【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种腺相关病毒生物素标记方法。
技术介绍
1、腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)是微小病毒科家族的成员之一，是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.70kb左右的线状单链dna基因组。
2、重组腺相关病毒(recombination adeno-associated virus,raav)是在非致病的野生型aav基础上进一步改造而成的新型基因载体，由于其理化性质稳定、安全性高、致病性弱、宿主细胞范围广、免疫原性低、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的特点，被视为最有前途的体内基因治疗产品载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用，作为一种有特点的基因转移载体，还广泛应用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除动物等方面。
3、生物素(biotin)即维生素b7，又称维生素h，是一种水溶性维生素。生物素因其为羧基转化酶的一种辅酶，故又称为辅酶r(coenzyme r)，其羧基经化学修饰后带有活性基团而成为活化生物素，活化后的生物素能与抗原、抗体等大分子生物活性物质及酶等示踪物结合。
4、n-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸n-琥珀酰亚胺酯(biotin-lc-lc-nhs)是一种生物素化试剂，它可以活化生物素上的羧酸基团以促进偶联反应，并且具有延长的间隔臂(30.5spacer)，从而有助于减少空间位阻，是一种理想的活化生物素试剂。biotin-
5、生物素－亲和素系统(biotin-avidin system,bas)：亲合素(avidin)也称抗生物素，是由4个相同亚基组成的大分子糖蛋白。1个亲合素分子能与4个生物素结合。两者结合的特异性高，稳定性好，亲合力极强(比抗原抗体间的亲合力至少高1万倍)。链霉亲合素(streptavidin)是与亲合素有类似生物学特性的一种蛋白质，但由于其不带糖基，且等电点低，分子表面所带正电荷少，与固相材料的非特异性结合远少于亲合素。因此，生物素－亲合素免疫检测系统在实际应用中多采用生物素－链霉亲合素系统(链霉亲和素和生物素结合作用是目前已知非共价结合中强度最高的)。生物素与链霉亲和素之间高亲合力的牢固结合及多级放大效应，极大地提高了免疫分析的灵敏度，因此，生物素－链霉亲合素免疫分析系统广泛应用于各种标记免疫分析技术中(如酶免疫、荧光免疫、放射免疫、胶体金及化学发光免疫等)。生物素标记物是实现生物素－链霉亲合素系统的基础。
6、目前，多采用体外化学修饰法进行生物素标记，即体外将待标记物质预先透析置换buffer(时长：≥2h)，取透析后的待标记物质和n-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素混合孵育一定时间(时长：≥0.5h)，然后再次透析去除未结合的生物素(时长：≥16h)，从而获得纯化的生物素标记物。该方法存在步骤繁琐(多次透析，多次换液)、耗时长(需要过夜)、目的蛋白损失较大、待标记物用量大等缺点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种腺相关病毒生物素标记方法，该方法具有简便、快速、标记效果好且待标记物质最小标记量低的优点。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种腺相关病毒生物素标记方法，该方法采用biotin-lc-lc-nhs溶液对腺相关病毒进行生物素标记，包括生物素标记、游离生物素去除、蛋白浓度测定和标记物保存步骤，其中生物素标记及游离生物素去除步骤均在超滤管中完成；
4、所述腺相关病毒和10mm biotin-lc-lc-nhs溶液的用量关系为1×1012vg腺相关病毒添加0.2μl～1.0μl的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液。
5、本专利技术所述的腺相关病毒生物素标记方法，是利用biotin-lc-lc-nhs可与伯氨基(-nh2)反应，形成稳定的、不可逆的酰胺键，从而达到对含有伯氨基(-nh2)的腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)进行生物素标记的效果。
6、作为优选，所述腺相关病毒和10mm biotin-lc-lc-nhs溶液的用量关系为1×1012vg腺相关病毒添加0.6μl的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液。
7、作为优选，所述超滤管是截留分子量为50kda～100kda的超滤管。优选millipore的超滤管。
8、作为优选，标记好的腺相关病毒加入等体积标记物保护液，-80℃可长期保存；所述标记物保护液具体为含2％bsa的甘油溶液，配方为：0.2g bsa+0.8g超纯水+9g甘油。
9、作为优选，所述biotin-lc-lc-nhs溶液是用二甲基亚砜(dmso)配制的10mmbiotin-lc-lc-nhs溶液；
10、腺相关病毒与10mm biotin-lc-lc-nhs溶液用量关系为：1×1012vg腺相关病毒添加0.2μl～1.0μl的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液。最佳值为0.6μl。
11、作为优选，该方法包括以下步骤：
12、s1生物素用量计算
13、按照1×1012vgaav添加0.2μl～1.0μl的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液，根据待标记aav的量计算所需的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液体积；
14、s2生物素标记
15、将待标的aav转移至超滤管中，加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液，12000×g离心10min(可以重复此步骤2～3次)，最后一次超滤完成，加入适量标记缓冲液调整待标记aav浓度到2×1013vg/ml；
16、加入适当体积的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀；放入37℃恒温箱中避光孵育30min或室温下避光孵育1h；
17、s3游离生物素去除
18、将标记后的aav放入离心机，室温下12000×g离心10min；
19、加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，轻轻吹打混匀，室温下12000×g离心10min，重复此步骤3次；
20、再次加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，轻轻吹打混匀，2000×g离心5min；将超滤管滤膜反向放置于收集管中，室温下12000×g离心2min；
21、s4蛋白浓度测定
22、使用超微量紫外可见光分光光度计，在280nm处测量生物素标记的aav的蛋白浓度；
23、s5标记物保存
24、收集超滤管中的溶液于棕色样品管中，加入等体积标记物保护液，-20℃保存。
25、作为优选，所述10mm biotin-lc-lc-nhs配制：准本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：该方法采用Biotin-LC-LC-NHS溶液对腺相关病毒进行生物素标记，包括生物素标记、游离生物素去除、蛋白浓度测定和标记物保存步骤，其中生物素标记及游离生物素去除步骤均在超滤管中完成；
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述腺相关病毒和10mM Biotin-LC-LC-NHS溶液的用量关系为1×1012vg腺相关病毒添加0.6μL的10mMBiotin-LC-LC-NHS溶液。
3.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述超滤管是截留分子量为50kDa～100kDa的超滤管。
4.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：标记好的腺相关病毒加入等体积标记物保护液，-80℃可长期保存；所述标记物保护液具体为含2％BSA的甘油溶液，配方为：0.2g BSA+0.8g超纯水+9g甘油。
5.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述Biotin-LC-LC-NHS溶液是用二甲基亚砜(DMSO)配制的10
6.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述10mM Biotin-LC-LC-NHS配制：准确称取10.0mg Biotin-LC-LC-NHS于棕色样品管中，加入1.761mLDMSO，拧紧管盖，轻轻混匀后室温下继续溶解30min，即得。
8.根据权利要求6所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述标记缓冲液配制：准确称取1.14gNa2HPO4、0.27g KH2PO4、8.01g NaCl、0.20g KCl至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后用超纯水定容至1.00L，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。
9.根据权利要求6所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述标记物保护液配制：准确称取0.2g BSA，0.8g超纯水，9g甘油于15mL试剂瓶中，置于旋转混匀仪上充分混匀，完全溶解后使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。
...【技术特征摘要】
1.一种腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：该方法采用biotin-lc-lc-nhs溶液对腺相关病毒进行生物素标记，包括生物素标记、游离生物素去除、蛋白浓度测定和标记物保存步骤，其中生物素标记及游离生物素去除步骤均在超滤管中完成；
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述腺相关病毒和10mm biotin-lc-lc-nhs溶液的用量关系为1×1012vg腺相关病毒添加0.6μl的10mmbiotin-lc-lc-nhs溶液。
3.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述超滤管是截留分子量为50kda～100kda的超滤管。
4.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：标记好的腺相关病毒加入等体积标记物保护液，-80℃可长期保存；所述标记物保护液具体为含2％bsa的甘油溶液，配方为：0.2g bsa+0.8g超纯水+9g甘油。
5.根据权利要求1所述的腺相关病毒生物素标记方法，其特征在于：所述biotin-lc-lc-nhs溶液是用二甲基亚砜(dmso)配...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡孟军，操德群，苏春超，卢孔鑫，毛鑫悦，吴涛，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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