【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及流式细胞，具体涉及一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、肿瘤的形成与机体免疫系统息息相关，肿瘤伴随诊断因子是肿瘤相关细胞因子，常由免疫细胞产生，与传统肿标不同。肿瘤伴随诊断因子从免疫系统进行监测，弥补了传统肿瘤标志物从肿瘤自身蛋白层面的分析，增加了肿瘤早期筛查的准确度。
2、转化生长因子α(transforming growth factor alpha，tgf-α)是表皮生长因子家族被鉴定的第二个成员，tgf-α与细胞迁移、生长和分化有关。tgf-α失调会引起各种上皮性癌症，而且还以旁分泌方式调节肿瘤微环境，使肿瘤与周围基质和免疫系统之间产生交叉对话。tgf-α在许多原发性上皮性肿瘤中表达增加，可以作为早期分子学反应(简称emr)的生物标志物之一，用于预测emr和深度分子反应。emr是慢性期慢性骨髓性白血病患者经过伊马替尼/格列卫治疗预后的有力预测因素。
3、转化生长因子β(transforming growth factorβ，tgf-β)是一种多功能细胞因子，在组织纤维化中参与炎症浸润、细胞生长、细胞凋亡和分化等过程。人类具有三种tgf-β亚型：tgf-β1，tgf-β2和tgf-β3。其中tgf-β1发挥强大的抗炎功能，是免疫反应的主调节器。在肿瘤性疾病中，tgf-β抑制早期病变的发展，但是到了后期，癌细胞中的自分泌和旁分泌tgf-β信号会促进其转移，还有助于肿瘤基质的形成、血管生成和免疫抑制。
4、粒细胞集落刺激因子(granulocyte
5、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，gm-csf)最初被认为是一种csf，属于造血细胞因子家族。gm-csf可能对肿瘤的进展和侵袭有直接影响。gm-csf的表达在许多人类癌症中被上调，在大多数这些癌症中，高水平的循环或肿瘤中的gm-csf水平与不良预后相关，例如gm-csf与血小板衍生的生长因子和血管内皮生长因子的表达增加与颈部鳞状细胞癌患者的侵袭和不良预后明显相关；gm-csf及其受体的高水平表达与结直肠癌患者的5年生存率提高有关。gm-csf通过免疫或非免疫机制作用于不同类型和发展阶段的肿瘤。
6、cxc趋化因子配体12(chemokine(c-x-c motif)ligand 12，cxcl12)，也被称为基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor，sdf-1)，属于趋化因子的cxc亚家族。在癌症中，cxcl12与其受体之间的结合导致不同的途径激活，通过癌细胞、迁移、血管生成和上皮向间质转化，参与肿瘤的发生和发展。cxcl12在肿瘤细胞与周围微环境的交流中起着重要作用。cxcl12和其受体的相互作用随后激发了下游的信号通路，影响了肿瘤的血管生成、肿瘤细胞的增殖和化疗抗性，因此是一个潜在的癌症治疗目标。测定cxcl12的表达有可能作为一种癌症生物标志物，并增加各种癌症类型的预后信息。
7、血管内皮生长因子-a(vascular endothelial growth factor，vegf-a)通常被为vegf，是vegf家族最重要、被研究最深入的成员。vegf-a是一种二聚体糖蛋白，具有两种主要的生物学活性：刺激血管内皮细胞增殖和增加血管通透性。肿瘤细胞的自分泌和旁分泌的vegf信号起到促进肿瘤发生的关键作用，包括癌症干细胞的自我更新和生存，而不依赖于血管生成。vegf的表达已被证明与瘤内tregs呈正相关，是各种恶性肿瘤不良后果的预后标志。
8、肿瘤的形成与机体免疫系统息息相关，肿瘤伴随诊断因子是肿瘤相关细胞因子，常由免疫细胞产生，综上所述，以上各因子均不同程度的参与了肿瘤的发生发展过程，可通过肿瘤伴随诊断因子的联合检测从免疫系统进行监测。
9、现有专利202210977129.2公开了一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法，能够对tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，但是，上述检测也存在亟待解决的问题：其方法局限性高，仅适用于悬浮芯片系统；操作繁琐，需要配备其一整套检测仪器和磁性微球试剂，检测成本高，难以普及；而且其检测范围窄，tgf-α：8.75–560pg/ml、tgf-β1：31.3–1000pg/ml、cxcl12：7.9–1018pg/ml、vegf：23.4–1497.6pg/ml、gm-csf：9.0–580pg/ml、g-csf：31.2–2000pg/ml；由于该检测方法中没有试剂对非特异性结合进行阻断，在实际使用中会存在假阳性的问题。
10、因此，有必要提供一种新型的试剂盒及其检测方法以解决现有技术中存在的上述问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法，能够对tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，能够在常规的流式细胞仪下实现同时检测，操作简洁、检测方便且成本低，且保持较高的灵敏度，不存在假阳性问题。
2、本专利技术为避免在上述六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测时发生假阳性，经过大量试验研究，找到了一种阻断剂溶液，使用兔igg对患者样本中潜在的人抗兔抗体进行阻断，并用鼠igg和hama阻断剂进行组合，极大改善了阻断效果，保持较高的灵敏度，不存在假阳性问题。
3、本专利技术为提高在上述六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测的过程中孵育的效果，经过大量试验研究，找到了一种孵育剂，乙二胺四乙酸二钠和透明质酸钠，能够显著降低检出限，其二者的组合能够协同作用、进一步降低检出限。透明质酸钠具有显著的增稠效果，能够提高体系的粘稠度以抑制微球沉降，促进微球分散；乙二胺四乙酸二钠能够提供络合效果，保持分散的体系结构的稳定，又能提供一定的流动性，促进孵育中反应的进行，提高灵敏度。
4、本专利技术检测过程中出现过基质效应，即基质对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。为消除这一基质效应，本专利技术经过大量试验研究，找到了一种基质，含有20％小鼠血清，能够避免基质对分析物的测定发生干扰，控制回收率在100±15％以内，增强检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括偶联抗体的微球混合液、生物素偶联抗体溶液、阻断剂溶液；所述阻断剂溶液包括兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂；所述抗体为抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体、抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括孵育剂，所述孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基质溶液，所述基质溶液包括牛血清白蛋白、小鼠血清、甘氨酸；所述小鼠血清为无内源检测靶点的小鼠血清，所述小鼠血清的体积百分数为20％。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联微球的抗体为兔单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联生物素的抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体去除Fc片段。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光试剂，
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括校准品、质控品，所述校准品、质控品由所述基质溶液配制为对应的校准品溶液、质控品溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括样品稀释液、洗涤缓冲液，所述样品稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300；所述洗涤缓冲液包括PBS缓冲液、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300。
9.如权利要求8所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
10.一种阻断剂溶液用于制备阻断检测肿瘤伴随诊断相关因子时的非特异性结合的制剂的用途，其特征在于，所述阻断剂溶液包括兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂；所述肿瘤伴随诊断相关因子包括TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括偶联抗体的微球混合液、生物素偶联抗体溶液、阻断剂溶液；所述阻断剂溶液包括兔igg、鼠igg、hama阻断剂；所述抗体为抗人tgf-α抗体、抗人tgf-β1抗体、抗人cxcl12抗体、抗人vegf抗体、抗人gm-csf抗体、抗人g-csf抗体中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括孵育剂，所述孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基质溶液，所述基质溶液包括牛血清白蛋白、小鼠血清、甘氨酸；所述小鼠血清为无内源检测靶点的小鼠血清，所述小鼠血清的体积百分数为20％。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联微球的抗体为兔单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联生物素的抗人tgf-α抗体、抗人tgf-β1抗体、抗人cxcl12抗体、抗人vegf抗体去除fc片段。
6.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：周延庆，徐陈槐，汪涛，
申请(专利权)人：杭州赛基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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