【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及用于产生重组触珠蛋白(hp)β链或其血红蛋白结合片段、重组hp分子的表达系统及其用于治疗和/或预防与无细胞血红蛋白(hb)的异常水平相关的病况的用途。
技术介绍
0、背景
1、红细胞溶解症的特征是红血球(红细胞)破裂，导致血红蛋白(hb)释放到血浆中，并且是与红细胞异常(例如酶缺陷、血红蛋白病(例如，地中海贫血)、遗传性球形红细胞增多症、阵发性睡眠性血红蛋白尿和刺细胞贫血)以及外在因素(例如脾肿大、自身免疫性疾病(例如新生儿溶血病)、遗传性疾病(例如镰状细胞病或g6pd缺乏症)、微血管病溶血、革兰氏阳性细菌感染(例如链球菌(streptococcus)、肠球菌(enterococcus)和葡萄球菌(staphylococcus))、寄生虫感染(例如疟原虫(plasmodium))、毒素、创伤(例如烧伤)、出血性中风、败血症、动脉粥样硬化、输血(特别是大量输血)以及使用体外心肺支持的患者)相关的贫血性疾病的标志(参见hoppe等人(1998,curropin pediatr；10(1):49-52)；roumenina(2016；trends in molecular medicine,22(3):200-213)；merle(2019,pnas116(13):6280-6285)；larsen(2010,science translational medicine:2(51):51ra71)；和balla g(2019,int j mol sci；20(15):3675)。
2、患有溶血
3、持续低水平细胞外hb/血红素暴露的进化压力导致了在生理稳态条件下和轻度溶血期间控制游离hb/血红素的不利影响的补偿机制。这些系统包括释放一组结合hb或血红素的血浆蛋白，包括hb清道夫hp和血红素清道夫蛋白，例如血红素结合蛋白(hpx)和α1-微球蛋白(参见schaer等人，2013；blood，121(8):1276-84)。
4、如上所述，血浆hp充当无细胞hb的清道夫，与无细胞hb结合以形成中和的hb:hp复合物(参见shim等人，1965，nature，207：1264-1267)。然而，当hb的量超过血浆hp的清除能力时，hb的局部积累(特别是在血管和肾组织中)导致氧化应激，其可能导致患者出现不良的次要结局。hp提供的保护至少可以减轻hb的两种毒理学后果。首先，hb:hp复合物的大分子尺寸防止细胞游离hb的外渗。这种机制通过限制游离hb进入血管壁来保护肾功能并保持血管一氧化氮(no)稳态(参见azarov等人,2008,nitric oxide；18(4):296-302)。其次，hb:hp复合物形成以限制血红素从其珠蛋白链转移到蛋白质和反应性脂质的方式稳定hb分子的结构(参见schaer等人(2014；frontiers in physiology,5:1-13)。这些机制在很大程度上负责溶血后的hp的抗氧化功能。
5、虽然内源性hp可以主要提供针对无细胞hb毒性的显著保护，但在更明显的急性或长期溶血期间，它迅速消耗和耗尽(参见boretti等人,2014；frontiers in physiology,5:385)。因此，hp的替代被认为是一种在体外和溶血动物模型中进行临床前概念验证的治疗方式。在大多数情况下，临床前研究评估了从汇集的人血浆级分中纯化的hp的治疗潜力。然而，这种方法有一些与临床实践相关的局限性，例如(1)不同hp表型(1-1、2-1和2-2)的混合可能在长期替代治疗期间触发某些患者的中和抗体反应，(2)不同的表型可能提供不同的功效，和(3)表型形式可能表现出不同的药代动力学。考虑到血浆来源的hp的潜在局限性，重组蛋白生产可能因此提供相关的治疗策略，其避免或以其他方式减轻至少一些上述血浆来源的hp的局限性。此外，重组蛋白生产策略可以产生具有增强功能、生物利用度和药代动力学的治疗剂。然而，最近通过表达前体分子(prohp)来生产重组hp的尝试已经注意到与hb的结合减少(参见heinderyckx等人,1988-1989,mol biol rep；13(4):225-32)。因此，仍然持续需要替代或改进的疗法来治疗和/或预防与无细胞hb相关的病况，其中hp的hb清除特性将是有益的。
技术实现思路
0、概述
1、本专利技术至少部分基于本专利技术人的令人惊讶的发现，即功能性触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段能够在哺乳动物表达系统中从n端截短的触珠蛋白原(prohp)产生。此外，可以有利地修饰n端截短的prohp以携带功能部分，例如hpx、fc或白蛋白，从而产生具有改善的治疗特性的构建体。
2、因此，在本文公开的一方面，提供了用于在哺乳动物细胞中产生重组触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段的表达系统，该表达系统包含：
3、(a)编码n端截短的触珠蛋白原(prohp)的第一核酸序列，其中所述n端截短的prohp包含(i)触珠蛋白α链的至少14个连续的c端氨基酸残基和(ii)触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段，并且其中n端截短的prohp包含触珠蛋白α链的至少14个连续的c端氨基酸残基和触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段之间的内部酶切割位点，和
4、(b)第二核酸序列，其编码能够在酶切割位点切割n端截短的prohp的酶；
5、其中，在将第一核酸序列和第二核酸序列引入哺乳动物细胞中，并且随后在细胞中表达n端截短的prohp和酶后，该酶能够在内部酶切割位点切割n端截短的prohp，从而从n端截短的prohp释放触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段。
6、在本文公开的另一方面，提供了用于在哺乳动物细胞中产生重组触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段的表达载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于在哺乳动物细胞中产生重组触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段的表达系统，所述表达系统包含：
2.权利要求1的表达系统，其中所述proHp是人proHp。
3.权利要求2的表达系统，其中所述人proHp包含与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
4.权利要求2的表达系统，其中所述N端截短的proHp包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基148至406具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求2的表达系统，其中所述N端截短的proHp包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基148至406具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
6.权利要求2的表达系统，其中所述N端截短的proHp包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基148至406具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求2的表达系统，其中所述N端截短的proHp基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸残基148至406组成。
8.权利要求1至7中任一项的表达系统，其中所述内部酶切割位点选自弗林蛋白
9.权利要求8的表达系统，其中所述内部酶切割位点是丝氨酸蛋白酶切割位点。
10.权利要求9的表达系统，其中所述丝氨酸蛋白酶切割位点是C1r样蛋白(C1rLP)切割位点或其功能变体。
11.权利要求9或权利要求10的表达系统，其中所述蛋白酶是C1rLP或其功能变体。
12.权利要求11的表达系统，其中所述C1rLP包含与SEQ ID NO：4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
13.权利要求1至12中任一项的表达系统，其中所述N端截短的proHp包含Hpα链的14个连续的C端氨基酸残基和Hpβ链之间的二硫键。
14.权利要求13的表达系统，其中所述N端截短的proHp包含在触珠蛋白α链的至少14个连续的C端氨基酸残基内和对应于SEQ ID NO：1的氨基酸位置266的位置处的半胱氨酸残基之间的二硫键。
15.权利要求13的表达系统，其中所述N端截短的proHp包含在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸位置149和266的位置处的半胱氨酸残基之间的二硫键。
16.权利要求1至15中任一项的表达系统，其中由所述第一核酸序列编码的N端截短的proHp包含另外的功能部分。
17.权利要求16的表达系统，其中所述另外的功能部分是治疗剂。
18.权利要求16或权利要求17的表达系统，其中所述另外的功能部分选自白蛋白、免疫球蛋白的Fc结构域或其FcRn结合片段和血红素结合蛋白或其血红素结合片段。
19.权利要求18的表达系统，其中所述另外的功能部分是血红素结合蛋白或其血红素结合片段。
20.权利要求16至19中任一项的表达系统，其中所述另外的功能部分连接至触珠蛋白α链的至少14个连续的C端氨基酸残基中的一个或多个。
21.权利要求20的表达系统，其中所述另外的功能部分连接至触珠蛋白α链的至少14个连续的C端氨基酸残基的N端。
22.权利要求21的表达系统，其中所述另外的功能部分通过接头连接至触珠蛋白α链的至少14个连续的C端氨基酸残基的N端。
23.权利要求22的表达系统，其中所述接头是肽接头。
24.权利要求18至23中任一项的表达系统，其中所述N端截短的proHp在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第一核酸序列可操作地连接的第一哺乳动物调节序列驱动，并且丝氨酸蛋白酶在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第二核酸序列可操作地连接的第二哺乳动物调节序列驱动。
25.权利要求20的表达系统，其中所述第一哺乳动物调节序列不同于所述第二哺乳动物调节序列。
26.权利要求18至25中任一项的表达系统，其中所述多肽在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第一核酸序列可操作地连接的第一哺乳动物调节序列驱动，并且丝氨酸蛋白酶在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第二核酸序列可操作地连接的第二哺乳动物调节序列驱动。
27.权利要求26的表达系统，其中所述第一哺乳动物调节序列不同于所述第二哺乳动物调节序列。
28.一种用于在哺乳动物细胞中产生重组触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段的表达载体，其中所述载体包含：
29.权利要求28的表达载体，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至共同的哺乳动物调节序列。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于在哺乳动物细胞中产生重组触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段的表达系统，所述表达系统包含：
2.权利要求1的表达系统，其中所述prohp是人prohp。
3.权利要求2的表达系统，其中所述人prohp包含与seq id no：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
4.权利要求2的表达系统，其中所述n端截短的prohp包含与seq id no：1的氨基酸残基148至406具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求2的表达系统，其中所述n端截短的prohp包含与seq id no：1的氨基酸残基148至406具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
6.权利要求2的表达系统，其中所述n端截短的prohp包含与seq id no：1的氨基酸残基148至406具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求2的表达系统，其中所述n端截短的prohp基本上由seq id no：1的氨基酸残基148至406组成。
8.权利要求1至7中任一项的表达系统，其中所述内部酶切割位点选自弗林蛋白酶切割位点、丝氨酸蛋白酶切割位点、半胱氨酸蛋白酶切割位点、天冬氨酸蛋白酶切割位点、金属蛋白酶切割位点和苏氨酸蛋白酶切割位点。
9.权利要求8的表达系统，其中所述内部酶切割位点是丝氨酸蛋白酶切割位点。
10.权利要求9的表达系统，其中所述丝氨酸蛋白酶切割位点是c1r样蛋白(c1rlp)切割位点或其功能变体。
11.权利要求9或权利要求10的表达系统，其中所述蛋白酶是c1rlp或其功能变体。
12.权利要求11的表达系统，其中所述c1rlp包含与seq id no：4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
13.权利要求1至12中任一项的表达系统，其中所述n端截短的prohp包含hpα链的14个连续的c端氨基酸残基和hpβ链之间的二硫键。
14.权利要求13的表达系统，其中所述n端截短的prohp包含在触珠蛋白α链的至少14个连续的c端氨基酸残基内和对应于seq id no：1的氨基酸位置266的位置处的半胱氨酸残基之间的二硫键。
15.权利要求13的表达系统，其中所述n端截短的prohp包含在对应于seq id no：1的氨基酸位置149和266的位置处的半胱氨酸残基之间的二硫键。
16.权利要求1至15中任一项的表达系统，其中由所述第一核酸序列编码的n端截短的prohp包含另外的功能部分。
17.权利要求16的表达系统，其中所述另外的功能部分是治疗剂。
18.权利要求16或权利要求17的表达系统，其中所述另外的功能部分选自白蛋白、免疫球蛋白的fc结构域或其fcrn结合片段和血红素结合蛋白或其血红素结合片段。
19.权利要求18的表达系统，其中所述另外的功能部分是血红素结合蛋白或其血红素结合片段。
20.权利要求16至19中任一项的表达系统，其中所述另外的功能部分连接至触珠蛋白α链的至少14个连续的c端氨基酸残基中的一个或多个。
21.权利要求20的表达系统，其中所述另外的功能部分连接至触珠蛋白α链的至少14个连续的c端氨基酸残基的n端。
22.权利要求21的表达系统，其中所述另外的功能部分通过接头连接至触珠蛋白α链的至少14个连续的c端氨基酸残基的n端。
23.权利要求22的表达系统，其中所述接头是肽接头。
24.权利要求18至23中任一项的表达系统，其中所述n端截短的prohp在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第一核酸序列可操作地连接的第一哺乳动物调节序列驱动，并且丝氨酸蛋白酶在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第二核酸序列可操作地连接的第二哺乳动物调节序列驱动。
25.权利要求20的表达系统，其中所述第一哺乳动物调节序列不同于所述第二哺乳动物调节序列。
26.权利要求18至25中任一项的表达系统，其中所述多肽在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第一核酸序列可操作地连接的第一哺乳动物调节序列驱动，并且丝氨酸蛋白酶在所述哺乳动物细胞中的表达由与所述第二核酸序列可操作地连接的第二哺乳动物调节序列驱动。
27.权利要求26的表达系统，其中所述第一哺乳动物调节序列不同于所述第二哺乳动物调节序列。
28.一种用于在哺乳动物细胞中产生重组触珠蛋白β链或其血红蛋白结合片段的表达载体，其中所述载体包含：
29.权利要求28的表达载体，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至共同的哺乳动物调节序列。
30.权利要求28的表达载体，其中所述第一核酸序列可操作地连接至第一哺乳动物调节序列并且所述第二核酸序列可操作地连接至第二哺乳动物调节序列，并且其中所述第一哺乳动物调节序列不同于第二哺乳动物调节序列。
31.用权利要求1至27中任一项的表达系...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·布彻，C·奥克扎莱克，T·金蒂纳塔，D·谢尔，M·霍格尔舒费尔，
申请(专利权)人：瑞士杰特贝林生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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