【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体而言，涉及一种生产d-对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用。
技术介绍
1、d-对羟基苯甘氨酸(d-hpg)是一种具有手性中心的非天然氨基酸，是氨基酸生物合成的重要中间体，广泛应用于合成肽类激素及农药，作为医药中间体，广泛用于制备β-内酰胺类抗生素，如阿莫西林、氨羟苄头孢菌素和头孢哌酮等，目前，d-hpg每年的总市场需求量高达10000吨，市场前景广阔。
2、d-hpg的制备方法主要有化学合成法及生物转化法。化学合成法存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低及生产成本高等问题，生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，受到了广泛的关注。
3、目前，已经有一些d-hpg的生物法制备路线被公开，例如，中国专利cn110396484a公开了一种d-对羟基苯甘氨酸的制备方法，首先对海泥样品中的菌进行富集、分离、纯化，多次筛选鉴定，得到能够同时产生海因酶和n-氨甲酰水解酶的菌株，然后需要进行粗酶提取以及酶活检测，选择酶活不低于0.3u/ml的酶制剂，催化反应底物d,l-对羟基苯海因，制备d-对羟基苯甘氨酸，此方法较为复杂、过程繁琐。中国专利cn112921012a通过结合定点饱和突变、组合突变及迭代饱和突变对cgdapdh的蛋白质进行改造，获得突变体，将其与pml-aad、sambhmas及pamdh偶联转化l-酪氨酸，获得的d-hpg产量为6.33g/l，转化率为68.6％。
4、以上报道的d-对羟基苯甘氨酸生物合成路线具有生产效率低，原料短缺，底物
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种生产d-对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用，该重组菌可以作为生物催化剂，将乙醛酸、苯酚、l-谷氨酸及氨转化为d-对羟基苯甘氨酸。
2、本专利技术的专利技术人在研究中发现了一种新的d-对羟基苯甘氨酸的合成路线，该合成路线是：通过酪氨酸酚裂解酶(tpl)将乙醛酸、苯酚及氨转化为l-对羟基苯甘氨酸，通过l-氨基酸氧化酶(laad)将l-对羟基苯甘氨酸转化为对羟基苯乙醛酸，通过d-丙氨酸转氨酶(daat)将对羟基苯乙醛酸转化为d-对羟基苯甘氨酸，以d-谷氨酸作为氨基供体被转化为2-氧代戊二酸，通过谷氨酸脱氢酶(gludh)将2-氧代戊二酸转化为l-谷氨酸，再通过氨基酸消旋酶(aar)将l-谷氨酸转化为d-谷氨酸，构建d-谷氨酸循环再生体系，反应过程中所需辅酶nadph由菌体代谢葡萄糖来提供。具体路线如图1所示。
3、上述合成方式是通过构建重组菌表达tpl、laad、daat、gludh和aar，再将其作为催化剂进行全细胞转化合成d-对羟基苯甘氨酸。
4、具体地，本专利技术是这样实现的：
5、第一方面，本专利技术提供了一种生产d-对羟基苯甘氨酸的重组菌，该重组菌表达tpl、laad、daat、gludh和aar。
6、其中，tpl包括rctpl和mmtpl；rctpl来源于rhodobacter capsulatus，genbank编号aac64208.1，其核苷酸序列如seq id no.11所示，氨基酸序列如seq id no.1所示；mmtpl来源于morganella morganii，genbank编号qsb63600.1，其核苷酸序列如seq id no.12所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、专利技术人在获得rctpl和mmtpl的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
8、laad包括xalaad和vdlaad；xalaad来源于xanthomonas arboricola，genbank编号cae6812941.1，其核苷酸序列如seq id no.13所示，氨基酸序列如seq id no.3所示；vdlaad来源于verticillium dahliae，genbank编号kah6690927.1，其核苷酸序列如seq idno.14所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。
9、专利技术人在获得xalaad和vdlaadl的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
10、daat包括bldaat和gsdaat；bldaat来源于brevibacillus laterosporus，genbank编号rap30467.1，其核苷酸序列如seq id no.15所示，氨基酸序列如seq id no.5所示；gsdaat来源于geobacillus stearothermophilus，genbank编号kyd34677.1，其核苷酸序列如seq id no.16所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。
11、专利技术人在获得bldaat和gsdaat的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
12、aar包括fbaar和elaar；fbaar来源于flavobacteria bacterium，genbank编号eaz94850.1，其核苷酸序列如seq id no.17所示，氨基酸序列如seq id no.7所示；elaar来源于eubacterium limosum，genbank编号alu13841.1，其核苷酸序列如seq id no.18所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。
13、专利技术人在获得fbaar和elaar的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
14、gludh包括ssgludh及ppgludh；ssgludh来源于streptomyces sp.，genbank编号wp_031092864.1，其核苷酸序列如seq id no.19所示，氨基酸序列如seq id no.9所示；ppgludh来源于palaeococcus pacificus，genbank编号wp_048165779.1，其核苷酸序列如seq id no.20所示，氨基酸序列如seq id no.10所示。
15、专利技术人在获得ssgludh和ppgludh的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
16、在一些实施例中，上述重组菌的构建方法包括：将tpl、laad、daat、gludh和aar的基因连接到双启动子表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。
17、在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他细菌，本专利技术不对其进行具体的限定。
18、在一些实施例中，大肠杆菌选自escherichia colibl2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、D-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，其来源于Rhodobacter capsulatus和Morganella morganii；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将乙醛酸、苯酚和L-谷氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、D-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在
8.一种合成D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于，其包括以乙醛酸、苯酚和L-谷氨酸为底物，利用权利要求1或2所述的重组菌进行全细胞转化合成D-对羟基苯甘氨酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系中包括：苯酚1-50g/L，乙醛酸1-40g/L，醋酸铵5-50g/L，L-谷氨酸1-10g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-50g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
...【技术特征摘要】
1.一种生产d-对羟基苯甘氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、d-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列如seq id no.1-2所示，其来源于rhodobacter capsulatus和morganella morganii；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将乙醛酸、苯酚和l-谷氨酸转化为d-对羟基苯甘氨酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、d-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，杨波，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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