【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种环状rna过表达的基因序列及其应用，尤其是涉及一种用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列及其应用。
技术介绍
1、白纹伊蚊(aedes albopictus)是登革病毒主要的传播媒介，其种群在全球范围内急剧扩张，被列为是“世界上100种最严重的外来入侵物种”之一，同时已被证实可传播至少26种病毒，对全球健康构成严重威胁。
2、环状rna(circular rna，circrna)是一种单链、通过特殊的反向拼接模式形成的闭环的内源性非编码rna(noncoding rna)，广泛存在于各物种中，具有保守、特异性时空表达特征、结构稳定、不易被rna酶消化降解、半衰期长等特点，其已在多种物种中被研究证实可以参与生物体的各项生理调控。尽管多种非编码rna(non-coding rna)，如mirna、pirna、lncrna等已被证实在蚊虫体内能发挥多种生物学作用，如抑制病毒增殖、影响成蚊的生殖发育等，但是蚊虫中的circrna研究还处于初始阶段，目前仅在白纹伊蚊和致倦库蚊中报道过有关circrna的研究。
3、限制蚊虫中circrna的研究进展，其中一个原因可能在于缺乏有效的研究手段，如蚊虫中circrna的过表达。研究特定某个circrna的功能，在细胞中过表达该circrna然后观察和检测细胞的变化是必不可少的一个手段。然而，目前可用的商业化circrna过表达载体都是用于哺乳动物细胞的表达。由于物种背景的差异，这些商业化载体中使用的启动子不适于在蚊虫系统中表达。
4、kramer et al等2015年发现，果蝇的circrna表达受到内含子上的反向互补重复序列调控，他们使用laccase2基因侧翼的内含子序列成功的在果蝇细胞系中过表达特定的circrna。果蝇和白纹伊蚊同属于双翅目昆虫，两者circrna的表达机制可能存在共同点。因此，参考果蝇细胞中circrna的过表达方式，寻找在白纹伊蚊基因组中可能介导circrna形成的内含子序列且探究其是否能够在白纹伊蚊体内外中介导circrna的表达。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列。
2、本专利技术的目的还在于提供一种包括上述用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列的过表达载体及其构建方法。
3、本专利技术的目的还在于提供上述过表达环状rna的基因序列或所述的过表达载体及其构建方法在白纹伊蚊c6/36细胞系体外或在白纹伊蚊体内过表达环状rna中的应用。
4、本专利技术的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列，包括上游反向互补重复序列以及下游反向互补重复序列，其中所述上游反向互补重复序列的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游反向互补重复序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列中的上游反向互补重复序列和下游反向互补重复序列，来源于白纹伊蚊基因组的内源性dna序列，普遍适用于伊蚊体内外环状rna的过表达，过表达效果好且稳定；该基因序列可整合到各种在伊蚊体内外系统中适用的表达载体中，应用含有该基因序列的伊蚊表达载体过表达环状rna操作简单易行。
6、本申请首先对白纹伊蚊成蚊体内表达丰度高的circrna的侧翼内含子序列进行分析，通过分析发现，其中源自于白纹伊蚊tret1-like基因(ncbi基因号：loc109428485)的第三、四号外显子形成的circrna，命名为aal-circrna-104，在该环状rna的基因组的位置上，其侧翼内含子存在两段重复的反向互补序列。
7、利用pcr的方法，通过设计特异性引物，以雌性白纹伊蚊基因组gdna为模板，使用高保真酶将aal-circrna-104及其侧翼的两段重复的反向互补序列一同扩增出来。将扩增得到的pcr片段连接商业载体并交给核酸公司进行该pcr片段的全长测序鉴定。通过测序鉴定，证实了aal-circrna-104基因组上的两端含有两段重复的反向互补序列。
8、进一步地，还包括所需表达的目的环状rna的序列及其剪接受体和剪接供体。
9、作为本专利技术其中一种优选的技术方案，所需表达的目的环状rna的序列为白纹伊蚊doublesex基因的第2号外显子。
10、即本专利技术所需过表达的目的环状rna为circrna-dsx(doublesex基因简称)，该分子来源于白纹伊蚊doublesex基因的第二号外显子。
11、进一步地，所述剪接受体与剪接供体为在白纹伊蚊doublesex基因第2号外显子基因组上侧翼的60nt剪接受体和剪接供体。
12、作为本专利技术另外一种优选的技术方案，所需表达的目的环状rna的序列为白纹伊蚊rna exonuclease 1homolog基因的第二号外显子。
13、即本专利技术所需过表达的目的环状rna为circrna-rex1(exonuclease 1homolog简称)，该分子来源于白纹伊蚊rna exonuclease 1homolog基因的第二号外显子。
14、进一步地，所述剪接受体与剪接供体为白纹伊蚊rna exonuclease 1homolog基因的第二号外显子基因组上侧翼的60nt剪接受体和剪接供体。
15、本专利技术的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种伊蚊体内外环状rna的过表达载体，包括上述过表达环状rna的基因序列。
16、可选地，所述表达载体通过以下方法获得：将所述过表达环状rna的基因序列插入到伊蚊聚泛素化启动子aepub序列下游，形成用于白纹伊蚊c6/36细胞系体外或白纹伊蚊体内circrna专用的过表达载体aepub-circrna-dsx或aepub-circrna-rex1。
17、进一步地，上述表达载体的构建方法，包括以下步骤：选取含有埃及伊蚊聚泛素化启动子aepub的质粒aepub-rfp(gift fromchun-hong chen)，对该质粒进行双酶切，得到线性化含有aepub启动子的载体，根据重叠pcr和同源重组的原理，通过设计特异性引物，将所述上游反向互补重复序列、所需表达的目的环状rna的线性dna序列及其侧翼60nt的剪接受体和剪接供体序列、所述下游反向互补重复序列用重叠pcr的方法拼接起来，然后将拼接片段纯化回收后，使用同源重组的方法将拼接片段与线性化aepub载体进行连接，得到专用的过表达载体aepub-circrna-dsx或aepub-circrna-rex1。
18、作为本专利技术一种推荐的实施方式，根据本申请专利技术人所在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状RNA的基因序列，其特征在于：包括上游反向互补重复序列以及下游反向互补重复序列，其中所述上游反向互补重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游反向互补重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状RNA的基因序列，其特征在于：还包括所需表达的目的环状RNA的序列及其侧翼剪接受体和剪接供体。
3.根据权利要求2所述的用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状RNA的基因序列，其特征在于：所需表达的目的环状RNA的序列为白纹伊蚊doublesex基因的第2号外显子，所述剪接受体与剪接供体为在白纹伊蚊doublesex基因第2号外显子基因组上侧翼的60nt剪接受体和剪接供体。
4.根据权利要求2所述的用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状RNA的基因序列，其特征在于：所需表达的目的环状RNA的序列为白纹伊蚊RNA exonuclease 1homolog基因的第二号外显子，所述剪接受体与剪接供体为白纹伊蚊RNA exonuclease 1homol
5.一种表达载体，其特征在于：包括权利要求3或4所述用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状RNA的基因序列。
6.权利要求1-4任一项所述的用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状RNA的基因序列或权利要求5所述的表达载体在白纹伊蚊C6/36细胞系体外或在白纹伊蚊体内过表达环状RNA中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列，其特征在于：包括上游反向互补重复序列以及下游反向互补重复序列，其中所述上游反向互补重复序列的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游反向互补重复序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列，其特征在于：还包括所需表达的目的环状rna的序列及其侧翼剪接受体和剪接供体。
3.根据权利要求2所述的用于载体介导的伊蚊体内外过表达环状rna的基因序列，其特征在于：所需表达的目的环状rna的序列为白纹伊蚊doublesex基因的第2号外显子，所述剪接受体与剪接供体为在白纹伊蚊doublesex基因第2号外显子基因组上侧翼的60...
【专利技术属性】
技术研发人员：高永辉，顾金保，
申请(专利权)人：深圳市惠楷健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。