【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质，和用于产生提取的植物脂质的方法。
技术介绍
1、ω-3长链多元不饱和脂肪酸(lc-pufa)现在被广泛公认为是用于人和动物健康的重要化合物。这些脂肪酸可从膳食来源中获得或者可通过转化亚油酸(la，18：2ω6)或α-亚麻酸(ala，18：3ω3)脂肪酸来获得，这两种脂肪酸均被认为是人膳食中的必需脂肪酸。虽然人和很多其它脊椎动物能够将从植物来源获得的la或ala转化为c22，但他们以极低的速率进行此转化。此外，最现代的社会具有不平衡的膳食，其中至少90％多元不饱和脂肪酸(pufa)为ω6脂肪酸，而不是被认为理想的4∶1比率或更少的ω6∶ω3脂肪酸(trautwein，2001)。人的lc-pufa如二十碳五烯酸(epa，20：5ω3)和二十二碳六烯酸(dha，22：6ω3)的直接膳食来源大部分来自鱼或鱼油。因此，健康专业人员推荐在人膳食中常规地包括含有显著水平的lc-pufa的鱼。逐渐地，鱼来源的lc-pufa油并入例如食物产品和婴儿配方中。然而，由于全球和国家渔业的下降，需要这些有利的增强健康的油的替代来源。
2、与动物相反，显花植物缺乏合成具有长于18个碳的链长度的多元不饱和脂肪酸的能力。具体地说，农作物和园艺植物连同其它被子植物不具有合成源于ala的较长链ω3脂肪酸如epa、二十二碳五烯酸(dpa，22：5ω3)和dha所需要的酶。因此，植物生物技术中的重要目标为对产生大量lc-pufa的农作物植物进行工程化，从而提供这些化合物的替代来源。
3、lc-
4、lc-pufa在有机体如微藻、苔藓和真菌中的生物合成通常作为一系列氧依赖性去饱和和延伸反应(图1)出现。在这些有机体中产生epa的最常见路径包括δ6-去饱和、δ6-延伸和δ5-去饱和(称为δ6-去饱和路径)，而较不常见的路径使用δ9-延伸、δ8-去饱和和δ5-去饱和(称为δ9-去饱和路径)。这些连续的去饱和反应和延伸反应可以ω6脂肪酸底物la(如图1的左上部分(ω6)示意性示出的)或者ω3底物ala开始，直到epa(如图1的右下部分(ω3)示出的)。如果对ω6底物la进行初始δ6-去饱和，三种酶的系列的lc-pufa产物将为ω6脂肪酸ara。lc-pufa合成有机体可使用如图1的δ17-去饱和酶步骤所示的ω3-去饱和酶将ω6脂肪酸转化为ω3脂肪酸，以用于将花生四烯酸(ara，20：4ω6)转化为epa。ω3-去饱和酶家族的一些成员可作用于范围为la至ara的多种底物。植物ω3-去饱和酶常明确催化la至ala的δ15-去饱和，而真菌和酵母ω3-去饱和酶对于araδ17-去饱和为epa可为特异的(pereira等，2004a；zank等，2005)。一些报道表明可存在非特异性ω3-去饱和酶，其可将各种各样的ω6底物转化为其对应ω3产物(zhang等，2008)。
5、在这些有机体中，通过epa的δ5-延伸来产生dpa，然后通过δ4-去饱和来产生dha(图1)，从而进行epa至dha的转化。与此相反，哺乳动物使用所谓的“sprecher”路径，所述路径通过独立于δ4-去饱和酶的三个独立反应将dpa转化为dha(sprecher等，1995)。
6、通常可见于植物、苔藓、微藻和低等动物如秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)中的前端去饱和酶主要接受与磷脂酰胆碱(pc)底物的sn-2位置酯化的脂肪酸底物。这些去饱和酶因此被称为酰基-pc、脂质连接的前端去饱和酶(domergue等，2003)。相比之下，高等动物前端去饱和酶通常接受酰基-coa底物，其中脂肪酸底物连接至coa，而不是pc(domergue等，2005)。已知一些微藻去饱和酶和一种植物去饱和酶使用与coa酯化的脂肪酸底物(表2)。
7、每个pufa延伸反应由通过多组分蛋白质复合物催化的四个步骤组成：首先，缩合反应引起来自丙二酰-coa的2c单元添加至脂肪酸，从而引起β-酮酯酰中间体的形成。然后，这通过nadph还原，然后脱水以产生烯酰基中间体。最终对此中间体进行第二次还原以产生延伸的脂肪酸。通常认为，这四个反应的缩合步骤为底物特异性的，而其它步骤则不是。实际上，这意味着只要引入对pufa特异的缩合酶(通常称为“延伸酶”)，原生植物延伸机构就能够延伸pufa，尽管原生植物延伸机构在延伸非原生pufa底物中的效率可能较低。在2007年，公布酵母延伸循环脱水酶的鉴别和表征(denic和weissman，2007)。
8、植物、苔藓和微藻的pufa去饱和天然发生于主要在酰基-pc库中的脂肪酸底物，而延伸发生于酰基-coa库中的底物。通过磷脂酶(pla)进行来自酰基-pc分子的脂肪酸至coa载体的转移，同时通过溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(lpcat)进行酰基-coa脂肪酸至pc载体的转移(singh等，2005)。
9、工程化地产生lc-pufa
10、使用需氧δ6-去饱和/延伸路径进行大部分lc-pufa代谢工程化。在1996年第一次报道使用来自集胞藻属(synechocystis)藻青菌的δ6-去饱和酶在烟草中生物合成γ-亚麻酸(gla，18：3ω6)(reddy和thomas，1996)。最近，已在农作物如红花(在种子油中的73％gla；knauf等，2006)和大豆(28％gla；sato等，2004)中产生gla。lc-pufa如epa和dha的产生由于所涉及的增加数目的去饱和和延伸步骤而涉及更复杂的工程化。通过qi等(2004)第一次报道陆生植物中的epa产生，他们将编码来自球等鞭金藻(isochrysis galbana)的δ9-延伸酶、来自眼虫藻(euglena gracilis)的δ8-去饱和酶以及来自高山被孢霉(mortierella alpina)的δ5-去饱和酶的基因引入到拟南芥属中，从而产生高达3％epa。此工作随后由abbadi等(2004)进行，他们报道在使用编码来自小立碗藓(physcomitrellapatens)的δ6-去饱和酶和δ6-延伸酶以及来自三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)的δ5-去饱和酶的基因的亚麻仁籽中产生高达0.8％epa。
11、dha产生的第一次报道是在wo 04/017467中，其中描述3％dha在大豆胚而不是种子中产生，这通过引入编码异枝水霉(saprolegnia diclina)δ6-去饱和酶、高山被孢霉δ6-去饱和酶、高山被孢霉δ5-去饱和酶、异枝水霉δ4-去饱和酶、异枝水霉δ17-去饱和酶、高山被孢霉δ6-延伸酶以及路氏巴夫藻(pavlova lutheri)δ5-延伸酶的基因来实现。在也产生dha的胚中的最大epa水平为19.6％，这指示epa转化为dha的效率较差(wo 2004/071467)。这个发现与由robert等(2005)公布的发现类似，其中从epa至dha的转变较低，其中在使用斑马鱼δ5/6-去饱和酶、秀丽隐杆线虫δ6-延伸酶以及盐生巴夫藻(p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于产生提取的植物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
2.权利要求1的方法，其中以TAG形式酯化的DPA的至少80％在所述TAG的sn-1或sn-3位置。
3.权利要求1或2的方法，其中所述脂质具有以下特征中的至少一个：
4.权利要求1或2的方法，其中SDA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4重量％。
5.权利要求1、2或4的方法，其中ETA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4重量％。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述外源多核苷酸在整合到所述种子的细胞的核基因组中的T-DNA分子中共价连接，并且其中整合到所述种子的细胞的核基因组中的此类T-DNA分子的数量是一个、两个或三个。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法还包括纯化所提取的脂质以去除核酸、蛋白质、碳水化合物、色素、游离脂肪酸(FFA)或磷脂中的一或多种。
8.权利要求7的方法，其中所提取的脂质经精炼、漂白并脱臭(RBD)。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述方法还包括处理所提取的脂质以增
10.提取的欧洲油菜脂质，其包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸，棕榈酸，包括亚油酸(LA)的ω6脂肪酸，包括α-亚麻酸(ALA)、二十二碳五烯酸(DPA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ETA)的ω3脂肪酸，其中棕榈酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为2重量％与16重量％之间，其中如果存在，肉豆蔻酸(C14:0)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于1重量％，其中以TAG形式酯化的DPA的至少70％在所述TAG的sn-1或sn-3位置，其中所述脂质提取自至少2,000,000株转基因欧洲油菜植物的种子，其中所述种子对于至少编码具有SEQ ID NO:4提供的氨基酸序列的Δ12-去饱和酶、具有SEQ ID NO:6提供的氨基酸序列的ω3-去饱和酶、具有SEQ ID NO:9提供的氨基酸序列的Δ6-去饱和酶、具有SEQ ID NO:20提供的氨基酸序列的Δ5-去饱和酶、具有SEQID NO:16提供的氨基酸序列的Δ6-延伸酶和具有SEQ ID NO:25提供的氨基酸序列的Δ5-延伸酶的外源多核苷酸是转基因的，并且其中每种多核苷酸与一或多个能够指导所述多核苷酸在所述转基因欧洲油菜植物中的发育种子中表达的启动子可操作连接。
11.权利要求10的脂质，其中以TAG形式酯化的DPA的至少80％在所述TAG的sn-1或sn-3位置。
12.权利要求10或11的脂质，其中SDA在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4重量％。
13.权利要求10-12任一项的脂质，其中ETA在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4重量％。
14.权利要求10-13任一项的脂质，其中所述脂质是精炼、漂白并脱臭的(RBD)。
15.通过权利要求9的方法生产的脂质，其中所述脂质在其脂肪酸含量中包含至少40重量％DPA。
16.一种生产转基因欧洲油菜种子的方法，所述方法包括
17.一种组合物，其包含权利要求10-15任一项的脂质。
18.一种原料，其包含权利要求10-15任一项的脂质。
19.一种生产原料的方法，所述方法包括将权利要求10-15任一项的脂质的一种或多种与至少一种其他食品成分混合。
20.权利要求19的方法，其中所述其他食品成分包含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质的一种或多种。
21.权利要求10-15任一项的脂质的一种或多种在制备用于治疗或预防得益于PUFA的病状的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种用于产生提取的植物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
2.权利要求1的方法，其中以tag形式酯化的dpa的至少80％在所述tag的sn-1或sn-3位置。
3.权利要求1或2的方法，其中所述脂质具有以下特征中的至少一个：
4.权利要求1或2的方法，其中sda在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4重量％。
5.权利要求1、2或4的方法，其中eta在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4重量％。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述外源多核苷酸在整合到所述种子的细胞的核基因组中的t-dna分子中共价连接，并且其中整合到所述种子的细胞的核基因组中的此类t-dna分子的数量是一个、两个或三个。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法还包括纯化所提取的脂质以去除核酸、蛋白质、碳水化合物、色素、游离脂肪酸(ffa)或磷脂中的一或多种。
8.权利要求7的方法，其中所提取的脂质经精炼、漂白并脱臭(rbd)。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述方法还包括处理所提取的脂质以增加作为总脂肪酸含量百分比的dpa水平，其中所述处理包括分馏、蒸馏、酯基转移、或所述方法的组合。
10.提取的欧洲油菜脂质，其包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸，棕榈酸，包括亚油酸(la)的ω6脂肪酸，包括α-亚麻酸(ala)、二十二碳五烯酸(dpa)、十八碳四烯酸(sda)、二十碳五烯酸(epa)和二十碳四烯酸(eta)的ω3脂肪酸，其中棕榈酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为2重量％与16重量％之间，其中如果存在，肉豆蔻酸(c14:0)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于1重量％，其中以tag形式酯化的dpa的至少70％在所述tag的sn-1或sn-3位置，其中所述脂质提取自至少2,000,000株转基因欧洲...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·R·皮特里，S·P·辛格，P·什雷斯塔，J·T·麦卡利斯特，M·D·迪瓦恩，R·C·德菲特，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：
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