抗制造技术

本发明专利技术属于基因工程抗体，特别涉及抗

【技术实现步骤摘要】
抗CD73单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用
[0001]本申请是申请号为
202011239238.1
，申请日为
2020
年
11
月
09
日，专利技术名称为“抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶的抗体序列”的中国专利技术专利申请的分案申请
。
申请人按照审查员的第一次审查意见提出分案申请
。


：
[0002]本专利技术属于基因工程抗体，特别涉及抗
CD73
单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用
。

技术介绍

：
[0003]胞外
‑5’‑
核苷酸酶
(ecto
‑5’‑
nucleotidase
，以下亦简称为
CD73)
，是多功能的胞外核酸酶，广泛分布于包括
T、B
淋巴细胞，巨噬细胞，树突状细胞，血管内皮，黏膜上皮细胞在内的多种组织细胞，在细胞内可同时发挥酶和非酶功能
。
[0004]研究证实，
CD73
过表达可以促进肿瘤细胞的增殖，且在大多数实体瘤中呈高表达，包括结直肠癌
、
卵巢癌
、
胃癌
、
胆囊癌
、
前列腺癌等，并与肿瘤分期
、
病理类型以及预后转归密切相关；
CD73
‑
腺苷途径在肿瘤进展和免疫逃逸中起着极其重要的作用，靶向/>CD73
能够明显提高
CTLA
‑4以及
PD
‑1抑制剂的抗肿瘤效应，
CD73
有望成为未来肿瘤免疫治疗的特效靶点
。
[0005]尽管目前已经有人研发了一些治疗型
CD73
单克隆抗体，其中，以
MEDI
‑
9447
和天镜生物的
CD73
抗体为代表
。
但是，抗体是
B
淋巴细胞在抗原刺激下所产生的具特异性免疫功能的球蛋白，单克隆抗体是由单个克隆的杂交瘤细胞分泌的，只能识别一种表位
(
抗原决定簇
)
的抗体
。
而针对同一个生物大分子的不同抗原表位可以制备出多种不同的单克隆抗体，即使抗原表位相同，获得的单抗序列也有可能不同
。
不同的序列以及靶位可能带来更优的药效或者更低的毒性以及更为广泛的抗瘤谱，开发出更多的抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶的抗体序列，才有可能解决更多的临床问题
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供多种有效的抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶
(
即
CD73)
的抗体序列，以用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物
。
[0007]本专利技术用人源
CD73
蛋白免疫小鼠，分别获得了五个抗
CD73
单克隆抗体，这些单克隆抗体的重链和轻链序列，均是全新的序列，现有技术未见报道过
。
[0008]本专利技术获得的五个抗
CD73
单克隆抗体中，其中四个抗体与现有技术抗体识别的抗原表位也不同
。
[0009]所用的
CD73
蛋白为申请人自主表达的人源
CD73
蛋白，所用的小鼠为
BABL/C
小鼠
。
[0010]具体的，本专利技术通过如下手段完成了上述工作：
[0011]A
人源
CD73
蛋白作为抗原以
30
μ
g/
只免疫
BABL/C
小鼠，三周后同样剂量加强免疫；
[0012]B ELISA
法测定免疫后小鼠血清中的抗体滴度，达到理想效果后以
50
μ
g
剂量冲击
免疫；
[0013]C
取免疫成功的小鼠脾细胞与
SP2/0
细胞进行融合，待细胞长成细胞团后进行上清滴度检测，通过三轮亚克隆获得阳性单克隆细胞株；
[0014]D
单克隆细胞株扩大培养后进行小鼠腹腔注射制备腹水，并从收集的腹水纯化得到相应的抗体；
[0015]E
利用
SPR
技术进行单克隆抗体的亲和动力学测定；
[0016]F
测定单克隆抗体对于
CD73
酶活性的抑制作用；
[0017]G
测定单克隆抗体对于移植瘤模型的肿瘤抑制作用
。
[0018]本专利技术获得的五个抗
CD73
单克隆抗体分别命名为：
F2
‑
2、E1
‑
B6、81
‑2‑
2、06
‑6和9‑
4。
这些抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区
CDR1、CDR2
和
CDR3
，这些区域是与抗原结合的关键部位
。
[0019]本专利技术获得的五个抗
CD73
单克隆抗体中，每个抗体的重链和中的
CDR1、CDR2
和
CDR3
分别是如下所示氨基酸序列的多肽：
[0020]F2
‑2：
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2
和
SEQ ID NO.3
；
SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5
和
SEQ ID NO.6
；
[0021]E1
‑
B6
：
SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10
和
SEQ ID NO.11
；
SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13
和
SEQ ID NO.14
；
[0022]81
‑2‑2：
SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18
和
SEQ ID NO.19
；
SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21
和
SEQ ID NO.22
；
[0023]06
‑6：
SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26
和
SEQ ID NO.27
；
SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29
和
SEQ ID NO.30
；
[0024]9‑4：
SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34
和
SEQ ID NO.35
；
SEQ ID NO.36、S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
抗
CD73
单克隆抗体，其重链和轻链可变区中的
CDR1、CDR2
和
CDR3
的氨基酸序列分别如下所述：重链可变区：
SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26
和
SEQ ID NO.27
；轻链可变区：
SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29
和...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖高勇，丁海剑，王灵，张怡，
申请(专利权)人：江苏中新医药有限公司，
类型：发明
国别省市：