一种用于合成稳定制造技术

本发明专利技术公开了一种用于合成稳定

【技术实现步骤摘要】
一种用于合成稳定PolyA尾巴的载体及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体及其制备方法
。

技术介绍

[0002]质粒模板制备是合成
mRNA
技术中最上游的部分，一个好的质粒模板对于体外转录合成反应合成
mRNA
的产量和纯度以及体内表达效果是至关重要的
。
[0003]在
mRNA
体外转录合成中，普遍通过质粒模板共转录的方式来添加
PloyA
尾巴，
PloyA
尾巴可以稳定
mRNA
，防止其发生降解，对于
mRNA
的制备发挥着至关重要的作用
。PolyA
尾巴添加方式有2种：一种是酶法合成，
mRNA
转录完成后，通过源自大肠杆菌的
PolyA
聚合酶添加；一种是共转录，由已经存在于模板质粒
DNA
或者
PCR
产物上的
PolyA
尾巴直接转录形成
。
常规模板质粒上构建的
A
尾一般是连续的
120
个
A
，但在质粒发酵生产中质粒序列上的
PolyA
尾巴经常会发生碱基丢失，造成尾巴缩短，无法实现生产的质粒
PolyA
尾巴的均一性
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体及其制备方法，以解决以下技术问题：防止模板质粒上构建的
PolyA
尾巴发生碱基丢失，提高质粒中
PolyA
尾在发酵
、
传代的过程的稳定性
。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体，所述载体为
30A
‑
L
‑
70A
载体
、120A
载体中任意一种，所述
30A
‑
L
‑
70A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述
120A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0007]作为本专利技术的进一步方案，所述用于快速合成
PolyA
基因的载体的制备方法，包括如下制备步骤：
[0008]步骤一：分段构建载体：分别构建前载体
、
后
60A
载体；
[0009]所述前载体为
30A+10bp+10A
载体
、
前
60A
载体中任意一种；
[0010]所述
30A+10bp+10A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；
[0011]所述前
60A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；
[0012]所述后
60A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；
[0013]步骤二：切连获得重组载体：将前载体
、
后
60A
载体分别通过
BsaI
酶进行酶切并回收得前载体的酶切片段
、
后
60A
载体的酶切片段后，将前载体的酶切片段
、
后
60A
载体的酶切片段通过
T4
酶连接，得重组载体；
[0014]步骤三：原核表达筛选出正确的优化前重组载体：将重组载体转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养
16
‑
20h
后，挑取平板上的单克隆进行菌落
PCR
，阳性克隆送测序，筛选出正确的优化前重组载体；
[0015]步骤四：加入发卡结构：将
PKBF
载体进行
PCR
后
PKBF
载体的
PCR
产物；得将优化前重
组载体采用
HindIII
和
AatII
进行酶切后与
PKBF
载体的
PCR
产物重组，转化入大肠杆菌感受态细胞后，复苏
1h
，涂平板培养
16
‑
20h
后，挑取平板上的单克隆进行菌落
PCR
，阳性克隆送测序，筛选出正确的优化后重组载体
。
[0016]本专利技术优化前
30A
‑
L
‑
70A
和优化前
120A
载体的线性化位点为
BsmBI
，也可将线性化位点变为
BspQI
，其余构建步骤均相同，也可实现相同功能
。
[0017]作为本专利技术的进一步方案，所述
30A+10bp+10A
载体包括如下步骤构建：
[0018]步骤
A1
：设计合成长退火引物；
[0019]步骤
A2
：
PCR
扩增
PKBF
载体并胶回收扩增产物，得
PKBF
载体的
PCR
产物；
[0020]步骤
A3
：将长退火引物与
PKBF
载体的
PCR
产物进行重组反应，得重组产物一；
[0021]步骤
A4
：将重组产物一转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养
16
‑
20h
后，挑取平板上的单克隆进行菌落
PCR
，阳性克隆送测序，筛选出正确的
30A+10bp+10A
载体
。
[0022]作为本专利技术的进一步方案，所述长退火引物的序列包括如下顺序的连续的碱基序列：
30
个连续的
A
碱基
、10bp
不连续碱基
、10
个连续的
A
碱基；所述长退火引物包括
IIS
类限制性内切酶酶切位点；所述
IIS
类限制性内切酶酶切位点与
BsaI
的酶切位点相同
。
[0023]作为本专利技术的进一步方案，所述前
60A
载体与后所述
60A
载体的构建步骤相同，所述前
60A
载体包括如下步骤构建：
[0024]步骤
B1
：设本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体，其特征在于，所述载体为优化后
30A
‑
L
‑
70A
载体
、
优化后
120A
载体中任意一种，所述优化后
30A
‑
L
‑
70A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述优化后
120A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
根据权利要求1所述的一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：步骤一：分段构建载体：分别构建前载体
、
后
60A
载体；所述前载体为
30A+10bp+10A
载体
、
前
60A
载体中任意一种；所述
30A+10bp+10A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；所述前
60A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；所述后
60A
载体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；步骤二：切连获得重组载体：将前载体
、
后
60A
载体分别通过
BsaI
酶进行酶切并回收得前载体的酶切片段
、
后
60A
载体的酶切片段后，将前载体的酶切片段
、
后
60A
载体的酶切片段通过
T4
酶连接，得重组载体；步骤三：原核表达筛选出正确的优化前重组载体：将重组载体转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养
16
‑
20h
后，挑取平板上的单克隆进行菌落
PCR
，阳性克隆送测序，筛选出正确的优化前重组载体；步骤四：加入发卡结构：将
PKBF
载体进行
PCR
后得
PKBF
载体的
PCR
产物；将优化前重组载体采用
HindIII
和
AatII
进行酶切后与
PKBF
载体的
PCR
产物重组，转化入大肠杆菌感受态细胞后，复苏
1h
，涂平板培养
16
‑
20h
后，挑取平板上的单克隆进行菌落
PCR
，阳性克隆送测序，筛选出正确的优化后重组载体
。3.
根据权利要求2所述的一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体的制备方法，其特征在于，所述
30A+10bp+10A
载体包括如下步骤构建：步骤
A1
：设计合成长退火引物；步骤
A2
：
PCR
扩增
PKBF
载体并胶回收扩增产物，得
PKBF
载体的
PCR
产物；步骤
A3
：将长退火引物与
PKBF
载体的
PCR
产物进行重组反应，得重组产物一；步骤
A4
：将重组产物一转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养
16
‑
20h
后，挑取平板上的单克隆进行菌落
PCR
，阳性克隆送测序，筛选出正确的
30A+10bp+10A
载体
。4.
根据权利要求3所述的一种用于合成稳定
PolyA
尾巴的载体的制备方法，其特征在于，所述长退火引物的序列包括如下顺序的连续的碱基序列：
30
个连续的
A
碱基
、10bp
不连续碱基
、10
个连续的
A<...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻明军，崔康乐，杨乾坤，纪世春，
申请(专利权)人：通用生物安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：