一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于cfDNA二代测序数据检测微卫星不稳定的装置、方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种基于
cfDNA
二代测序数据检测微卫星不稳定的装置
、
方法及其应用
。

技术介绍

[0002]微卫星
(Microsatellite
，简称
MS)
是基因组中短的串联重复片段或单核苷酸重复序列；其重复单元的长度一般在1‑6碱基，重复次数一般在4次以上
。
微卫星的重复单元发生插入或缺失导致其长度发生变化，这一现象称为微卫星不稳定性
(Microsatellite Instability
，简称
MSI)。MSI
现象于
1993
年在一类遗传性的结直肠癌中被首次描述
(Arzimanoglou I I,Gilbert F,Barber H R,Microsatellite instability in human solid tumors.Cancer,1998,82:1808
‑
20)
，该现象一般与错配修复
(Mismatch Repair
，
MMR)
基因缺陷有关
(Thibodeau S N,French AJ,Roche P C et al.Altered expression of hMSH2 and hMLH1 in tumors with microsatellite instability and genetic alterations in mismatch repair genes.Cancer Res,1996,56:4836
‑
40)
，与肿瘤的发生路径和分类密切相关
。
目前，在结直肠癌
、
胃癌
、
子宫内膜癌
、
脑胶质瘤等癌种中已有许多与
MSI
状态相关的研究
。
并已作为结直肠癌和一些其它癌种的预后预测及治疗方案选择的重要分子标志物
。2017
年，美国食品药品管理局批准
Keytruda(pembrolizumab)
用于治疗具有
MSI
‑
H
或
dMMR
特征，且不可切除或已转移的成人及儿童实体瘤，这是
FDA
首次批准一种基于肿瘤基因型而与肿瘤原发部位无关的实体瘤药物
(U.S.Food and Drug Administration.FDA approves first cancer treatment for any solid tumor with a specific genetic feature.2017)。
[0003]第一代
MSI
检测基于聚合酶链式反应
(PCR)
检查基因组上数个位点的长度变化确定样本的
MSI
状态
。
位点系统有
1997
年确定的3个双核苷酸加2个单核苷酸位点
(Boland C R,Thibodeau S N,Hamilton S R et al.A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition:development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res,1998,58:5248
‑
57)
以及
2004
年改进版本的5个单核苷酸位点
(Bacher J W,Flanagan L A,Smalley R L et al.Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI
‑
High tumors.Dis Markers,2004,20:237
‑
50)
；该方法通过对所选位点合成引物
、PCR
后凝胶电泳，并人工比较来自肿瘤组织与正常组织的结果，确定
MS
位点是否发生了显著的长度改变；当有2个或以上位点发生改变时认为样本状态为微卫星高度不稳定
(Microsatellite Instability High
，
MSI
‑
H)
，有1个位点发生改变认为是微卫星低度不稳定
(Microsatellite Instability Low
，
MSI
‑
L)
，所有位点均稳定则认定为微卫星稳定
(Microsatellite Stable
，
MSS)
；后期大部分研究认为
MSI
‑
L
与
MSS
可归为一类，目前实践中也遵循这一标准
。
该方法被认为是癌症
MSI
检测，
特别是结直肠癌
MSI
检测的金标准，但基于
PCR
的方法操作较复杂
、
花费较高，且结果判读一定程度上受人工因素影响
。
[0004]MSI
状态与
MMR
通路蛋白有关，基于免疫组化
(Immunohistochemistry
，
IHC)
检测
MMR
通路蛋白
(MMR
‑
IHC)
是否正常也可以判断
MSI。
一般检测4个主要蛋白
(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)
，如果任一蛋白出现问题则为错配修复缺陷
(deficient Mismatch Repair
，
dMMR)
，该状态会导致
DNA
复制过程中损伤逐渐积累最终导致
MSI
‑
H。
但有时
MMR
蛋白的突变导致其失去功能但仍保留抗原性，因此
MMR
‑
IHC
检测结果无异常，此外通路上其它蛋白也可能突变影响整体功能，因此在实际检测中，
dMMR
结果与
MSI
结果尚有一定出入，不能完全相互替代
。
并且该方法需要病理医生阅片，因此也具有一定主观性
。
[0005]二代测序技术
(Next Gener本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
检测微卫星不稳定性的装置，其特征在于：所述装置包括如下模块：
A1)
测序数据获得和分析模块：用于获取待测肿瘤患者和健康人的外周血样本
cfDNA
的原始测序数据，经质控后获得有效测序数据，将所述有效测序数据比对到参考基因组得到比对结果文件，所述比对结果文件含有比对片段和所述比对片段的比对信息；
A2)
前端模块：用于分别截取
101
个
MS
位点在人参考基因组的位置及其上下游序列片段获得每个所述
MS
位点的参考序列，从所述比对结果文件中分别截取所述
101
个
MS
位点及其上下游序列片段，获得所述样本每个所述
MS
位点的比对序列，使用
SW
算法将每个所述
MS
位点的所述比对序列重新比对到每个所述
MS
位点的参考序列，得到所述样本的重比对结果文件；保留所述重比对结果文件中测穿所述
101
个
MS
位点的比对片段，得到过滤重比对结果文件；将所述过滤重比对结果文件经过分子标签一致性分析得到所述样本每个所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的原始支持数；将所述样本的每个所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的原始支持数求和，得到所述样本每个所述
MS
位点的总支持数，基于所述总支持数判断每个所述
MS
位点质控是否合格；处理每个质控合格所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的原始支持数，获得所述样本的每个所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的最终支持数；
A3)
构建参考集模块：用于将健康人的外周血
cfDNA
经
A1)
获得的比对结果文件，使用
A2)
所述前端模块分析获得所述健康人每个所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的最终支持数，基于所述健康人每个所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的最终支持数，获得参考集每个所述
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的基线值；
A4)
后端模块：用于基于
A3)
获得的每个
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的基线值乘以权重系数获得所述样本每个
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的加权基线值；使用
A2)
得到所述待测肿瘤患者的每个
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的最终支持数减去所述加权基线值，获得所述待测肿瘤患者每个
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的原始得分；基于所述原始得分乘以权重系数获得所述待测肿瘤患者的每个
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的最终得分；将所述待测肿瘤患者的每个
MS
位点每种单核苷酸重复序列长度的最终得分求和得到所述待测肿瘤患者的每个
MS
位点的最终得分；将所述每个
MS
位点的最终得分与阈值比较判断所述待测肿瘤患者每个
MS
位点是阴性还是阳性；将所述待测肿瘤患者所有
MS
位点的最终得分求和得到所述待测肿瘤患者的最终得分；基于所述待测肿瘤患者的阳性位点数量以及待测肿瘤患者的最终得分确定所述待测肿瘤患者的微卫星不稳定性；所述
101
个
MS
位点为如下
MS1
‑
MS101
：
MS1
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr1
：
6257785
‑
6257792
；
MS2
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr1
：
22033386
‑
22033397
；
MS3
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr1
：
33402335
‑
33402351
；
MS4
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr1
：
39751173
‑
39751187
；
MS5
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr1
：
161091815
‑
161091831
；
MS6
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr1
：
236714293
‑
236714310
；
MS7
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
39536690
‑
39536716
；
MS8
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
47641560
‑
47641586
；
MS9
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
48032741
‑
48032753
；
MS10
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
48033891
‑
48033908
；
MS11
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
62063094
‑
62063110
；
MS12
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
66796099
‑
66796108
；
MS13
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
95849362
‑
95849384
；
MS14
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
120714402
‑
120714417
；
MS15
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
138721943
‑
138721959
；
MS16
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
148683686
‑
148683693
；
MS17
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
190687176
‑
190687184
；
MS18
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr2
：
217280262
‑
217280276
；
MS19
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr3
：
30691872
‑
30691881
；
MS20
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr3
：
44373518
‑
44373532
；
MS21
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr3
：
71008342
‑
71008354
；
MS22
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr4
：
55598212
‑
55598236
；
MS23
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr4
：
55976948
‑
55976960
；
MS24
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr4
：
74285192
‑
74285203
；
MS25
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr4
：
141448596
‑
141448609
；
MS26
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr5
：
16474779
‑
16474794
；
MS27
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr5
：
121362853
‑
121362863
；
MS28
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr5
：
132425416
‑
132425429
；
MS29
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr5
：
134086671
‑
134086683
；
MS30
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr5
：
158526535
‑
158526549
；
MS31
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr6
：
32166161
‑
32166173
；
MS32
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr6
：
43021977
‑
43021988
；
MS33
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr6
：
64289939
‑
64289953
；
MS34
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr6
：
157495952
‑
157495965
；
MS35
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr6
：
163899795
‑
163899806
；
MS36
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
5239320
‑
5239335
；
MS37
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
27868484
‑
27868500
；
MS38
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
30673513
‑
30673527
；
MS39
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
54819994
‑
54820004
；
MS40
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
74608741
‑
74608753
；
MS41
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
116381122
‑
116381137
；
MS42
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr7
：
143003343
‑
143003367
；
MS43
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
7346867
‑
7346875
；
MS44
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
7679728
‑
7679736
；
MS45
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
30933817
‑
30933828
；
MS46
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
32488248
‑
32488262
；
MS47
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
32528648
‑
32528661
；
MS48
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
32548236
‑
32548246
；
MS49
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
32551070
‑
32551085
；
MS50
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
32584436
‑
32584448
；
MS51
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
33356192
‑
33356207
；
MS52
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
33356826
‑
33356838
；
MS53
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
38321489
‑
38321499
；
MS54
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
79629739
‑
79629752
；
MS55
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr8
：
103287851
‑
103287863
；
MS56
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr9
：
27062803
‑
27062815
；
MS57
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr9
：
87314579
‑
87314591
；
MS58
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr9
：
130571226
‑
130571245
；
MS59
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr10
：
8115669
‑
8115686
；
MS60
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr10
：
32575774
‑
32575784
；
MS61
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr10
：
115963127
‑
115963135
；
MS62
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr11
：
59368219
‑
59368234
；
MS63
对应人参考基因组
GRCh37
的
chr11
：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：马景娇，
申请(专利权)人：北京泛生子基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：