一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物制造技术

本发明专利技术属于生物技术和分子诊断领域，公开了一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物

【技术实现步骤摘要】
一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物、试剂盒以及方法


[0001]本专利技术涉及属于生物技术和分子诊断领域，具体地涉及一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物
、
试剂盒以及方法
。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌
(Helicobacter pylori
，
Hp)
是一种螺旋形
、
微厌氧
、
对生长条件要求十分苛刻的革兰氏阴性杆菌，是世界上流行范围最广的病原体，全世界大约有
50
％的人感染了幽门螺杆菌，而在我国有
40
％
‑
70
％的人群感染幽门螺杆菌
。
幽门螺杆菌主要引起胃肠道消化系统相关疾病，如慢性胃炎
、
胃溃疡
、
十二指肠溃疡
、
胃癌等等
。
目前对幽门螺杆菌的治疗主要采用含有抗生素的三联或四联疗法进行，而随着抗生素的大量使用，幽门螺杆菌已经出现了抗生素的耐药现象，这就导致由于抗菌药物的选择，患者服药的依从，患者自身用药历史等因素幽门螺杆菌的根除率达不到很高
。
因此，幽门螺杆菌的耐药检测对临床用药的指导具有重要意义
。
[0003]目前，用于幽门螺杆菌耐药的方法主要有药敏试验法，一代测序法，溶解曲线法，以
PCR
为基数的变性高效液相色谱的方法，
PCR
‑
FISH
法
。
药敏试验，即通过培养
Hp
与不同抗生素进行体外反应从而确定其最低抑菌浓度来判断是否耐药；大致步骤为：从病人的感染部位采取含致病菌的标本，接种在适当的培养基上，于一定条件下培养；同时将分别沾有一定量各种抗生素的纸片贴在培养基表面
(
或用不锈钢圈，内放定量抗生素溶液
)
，培养一定时间后观察结果
。
由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现不同大小的抑制病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈；抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系；然后根据试验结果有针对性地选用抗生素；该方法步骤复杂耗时长，且不容易培养出幽门螺杆菌
。
一代测序法实验周期较长，对于突变频率较低的样本检出率低，只能检测
10
％以上的突变
。PCR
为基数的变性高效液相色谱的方法简单快速但只能提供样本有无突变的信息，需要结合序列分析才能得出具体的突变类型
。PCR
‑
FISH
发不能确定除了克拉霉素以外其他抗生素的耐药性
。
[0004]以上方法都需要获得患者的胃粘膜组织样本，而样本采集则需要通过胃镜钳取病人感染部位胃组织黏膜，对患者具有侵入性，在引起患者的不适的同时也容易造成创伤
。
因此，针对幽门螺杆菌耐药检测有必要开发快速
、
灵敏
、
便捷采样
、
低成本的检测体系，以满足临床需要
。

技术实现思路

[0005]针对目前所存在的技术问题，本专利技术提供了一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合
、
试剂盒以及方法
。
本专利技术的引物探针组合及试剂盒的检测敏度高
、
特异性强
、
抗干扰能力和重复性好
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术一方面提供了一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物，所述引物探针组合物由四个突变位点的四条上游扩增引物
、
一条下游扩增引物和一条检测探针组成，具体包括：
(1)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Ser414Arg
突变的第一靶标序列的第一上游引物，序列为
SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.6
中的任一个；
[0008](2)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Thr556Ser
突变的第二靶标序列的第二上游引物，序列为
SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.12
中的任一个；
[0009](3)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Asn562Tyr
突变的第三靶标序列的第三上游引物，序列为
SEQ ID NO.13
‑
SEQ ID NO.18
中的任一个；
[0010](4)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Thr593Ala
突变的第四靶标序列的第四上游引物，序列为
SEQ ID NO.19
‑
SEQ ID NO.24
中的任一个；
[0011](5)
用于与
(1)
‑
(4)
任一上游引物配合，扩增包含
PBP1 A
基因相应突变位点的靶标序列的下游引物，序列为
SEQ ID NO.25
‑
SEQ ID NO.28
中的任一个；
[0012](6)
用于检测
(1)
‑
(4)
上游引物分别与
(5)
下游引物扩增得到的任一扩增子的探针，序列为
SEQ ID NO.29
，
SEQ ID NO.30
中的任一个，探针5’
端标记有激发荧光集团，探针的3’
端标记有淬灭集团
。
[0013]在一些具体实施方案中，所述引物探针组合物中：第一上游引物序列如
SEQ ID NO.4
或
SEQ ID NO.5
所示；第二上游引物序列如
SEQ ID NO.7
或
SEQ ID NO.8
所示；第三上游引物序列如
SEQ ID NO.13
或
SEQ ID NO.14
所示；第四上游引物序列如
SEQ ID NO.19
或
SEQ ID NO.20
所示
。
[0014]在另外一些优选实施方案中，所述引物探针组合物为：
(1)
第一上游引物，序列如
SEQ ID NO.4
所示；
(2)
第二上游引物，序列如
SEQ ID NO.8
所示；
(3)
第三上游引物，序列如
SEQ ID NO.13
所示；
(4)
第四上游引物，序列如
SEQ ID NO.20
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物包括：
(1)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Ser414Arg
突变的第一靶标序列的第一上游引物，序列为
SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.6
中的任一个；
(2)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Thr556Ser
突变的第二靶标序列的第二上游引物，序列为
SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.12
中的任一个；
(3)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Asn562Tyr
突变的第三靶标序列的第三上游引物，序列为
SEQ ID NO.13
‑
SEQ ID NO.18
中的任一个；
(4)
用于扩增包含
PBP1 A
基因
Thr593Ala
突变的第四靶标序列的第四上游引物，序列为
SEQ ID NO.19
‑
SEQ ID NO.24
中的任一个；
(5)
用于与
(1)
‑
(4)
任一上游引物配合，扩增包含
PBP1 A
基因相应突变位点的靶标序列的下游引物，序列为
SEQ ID NO.25
‑
SEQ ID NO.28
中的任一个；
(6)
用于检测
(1)
‑
(4)
上游引物分别与
(5)
下游引物扩增得到的任一扩增子的探针，序列为
SEQ ID NO.29
，
SEQ ID NO.30
中的任一个，探针5’
端标记有激发荧光集团，探针的3’
端标记有淬灭集团
。2.
根据权利要去1所述的一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中，第一上游引物序列如
SEQ ID NO.4
或
SEQ ID NO.5
所示；第二上游引物序列如
SEQ ID NO.7
或
SEQ ID NO.8
所示；第三上游引物序列如
SEQ ID NO.13
或
SEQ ID NO.14
所示；第四上游引物序列如
SEQ ID NO.19
或
SEQ ID NO.20
所示
。3.
根据权利要求1或2任一项所述的一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物还包括内标基因的引物和探针：内标基因上游引物序列如
SEQ ID NO.31
所示，内标基因下游引物序列如
SEQ ID NO.32
所示，内标基因探针序列如
SEQ ID NO.33
所示，内标基因探针5’
端标记有激发荧光集团，探针的3’
端标记有淬灭集团
。4.
权利要求3所述的引物探针组合物在制备用于检测幽门螺杆菌耐药试剂或试剂盒中的应用
。5.
一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物探针组合物
。6.
根据权利要求5所述的一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物中，第一上游引物，第二上游引物，第三上游引物，第四上游引物的摩尔比为1：1：1：
1。7.
根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红艳，李杨霞，吕棠山，齐晨，唐文欣，李想，吴苑，程金放，
申请(专利权)人：浙江默乐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：