杨树转抗虫基因技术制造技术

本发明专利技术属于生物工程、生物遗传工程技术，涉及一种杨树转抗虫基因技术。其特征在于：是以杨树优良品种欧美杨１０７为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；本发明专利技术可培育转基因抗虫及耐干旱、耐盐碱、抗风沙的速生杨树，应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目。转基因杨具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面有广阔的市场前景。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利属于生物工程、生物遗传工程技术，涉及一种杨树转抗虫基因技术。
技术介绍
杨树是退耕还林的主要树种之一，具有适应地域广，生长速度快，成活率高、种植简单等特点。国内外均将其作为绿化环保的首要树种，用于防风固沙、保上留肥、防止土壤沙化。欧美许多发达国家运用转基因等先进手段对杨树进行改良研究。欧美杨107属黑杨欧美杨杂交品种，起源于意大利，1984年引入我国，是从17个国家引进的331个无性系中选育出来的6个新品种之一。特性特征是树干高大通直、树皮灰色较粗、分枝角度小、树冠窄、侧枝细、叶片小而密、满冠；雌株。速生，胸径年平均生长量3.5～5cm，树高平均生长量3.5M，3～4年伐可作纸浆材及中小径民用材，7～8年主伐可作于径材。于径通直、材质优良，其纤维长度和木材密度均优于I-214杨等普通杨树，是纸浆材和板材的优良树种，纤维长度1145μm，木材密度0.395，形率为0.66。树冠窄，抗风能力强，不易风倒、风折。抗病虫害，对光肩星天牛具有明显抗性。抗寒，最低温-31℃可安全越冬。
技术实现思路
本专利技术的目的是为增加杨树对榆毒蛾幼虫和天幕毛幼虫的杀虫活性，加快杨树生长速度，降低主要病虫害造成的损失，提高林木经济价值，提供一种杨树转抗虫基因技术。本专利技术杨树转抗虫基因
技术实现思路
简述本专利技术杨树转抗虫基因技术，其特征在于是以杨树优良品种欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；试验选用的材料为1、菌种和质粒含Bt基因的植物表达载pCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404； 2、植物材料欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)；3、供试昆虫榆毒蛾(Leucoma candida Staudmder)幼虫和天幕毛虫幼虫；4、主要化学试剂Km (卡那霉素)、Cb (羧苄青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR扩增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA；5、培养基(1)、农杆菌培养基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏( Beet Extract)5g/L；酵母提取物((YeastExtract)5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；固体则加入1.4％琼脂，以1mol/LNaOH调pH值为7.2；(2)、植物组织培养基以MS为基本培养基，附加不同浓度激素，配置各种培养基继代培养基MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；共培养培养基茎段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L叶片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L筛选分化培养基茎段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；叶片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg5mg/L+250mg/LCb；生根培养基MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；各培养基均含3％蔗糖和0.7％琼脂，PH值为5.8，抗生素抽滤灭菌，其它成分高压灭菌；杨树转抗虫基因技术方法为1、潮霉素临界浓度的确定设计6个潮霉素的浓度梯度0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段，切成0.5cm大小，置于培养基中，一个月后观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；2、菌液的准备(1)、菌种的活化从甘油管中挑取含有植物植物表达载体的农杆菌菌液划线于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒温箱中，过夜培养形成单菌落；(2)、菌液的培养从平板上挑取农杆菌单菌落，接种于10mlYEB液体培养基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震荡培养过夜，次日早晨取过夜培养的菌液0.8～1ml加至20ml新鲜的不含抗生素的YEB液体培养基中，继续震荡培养3～5h，至菌液浓度OD600＝0.3～0.5时，8000rpm离心5min，沉淀用MS液悬浮，并稀释20～30倍即可用于转化；3、叶盘法转化杨树利用叶盘法(Horsch，1985)对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，室温下不断摇动使外植体与菌液充分接触10min，取出后用无菌滤纸吸去表面多于的菌液，放入铺有一层滤纸的共培养培养基中，25℃下暗培养2～3d，然后转入选择分化培养基中培养；4、菌液浓度及侵染时间对转化效果的影响(1)、菌液浓度的影响取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD600值为0.1、0.3、0.5、0.8的农杆菌菌液中侵染10min，观察不同的菌液浓度对转化效果的影响；(2)、侵染时间的影响取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD600值为0.3、0.5、的农杆菌菌液中侵染10、20、30、40min，观察不同侵染时间对转化效果的影响；5、转化植株的获得经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，在温度为25～28℃，光/暗周期为16/8h的条件下培养两周后，逐渐有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，当抗性芽长至2cm左右时，转移至生根培养基上诱导生根；6、转化植株的鉴定(1)、潮霉素抗性鉴定取转化植株的叶片和非转化对照植株的叶片，切成0.5～1cm大小，放置含有Hyg5mg/L的分化培养基上，观察其分化状况；将转化芽与非转化芽分别接种于含有Hyg7mg/L的继代培养基中观察其生长情况；(2)、转基因植株的PCR检测质粒DNA的提取挑取农杆菌单菌落接种于5mlYEB液体培养基中(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)，28℃震荡培养过夜，将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，8000rpm离心3min，收集菌体；倒掉上清液，沉淀中加入10ul溶液1(50mM葡萄糖、25mMTris-Hcl，PH8.0，10mMEDTA-Na2，PH80)，以牙签悬浮菌体，冰浴5～10min；加入200ul溶液2(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，轻轻颠倒混匀，冰浴10～15min；10000rpm离心5min，上清用等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)反复抽提2～3次；水相转入新管，加入两倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，10000rpm离心8min，沉淀吹干后溶于适量TE缓冲液中；植物总DNA的提取取适量新鲜的植物叶片，置于研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将研碎的样品转入无菌离心管中，立即加入400ulSDS提取缓冲液(100mM NaCL，50mMEDTA，0.5％SDS，50mMTris，PH7.4)轻轻混匀粉末，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)颠倒混匀，100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杨树转抗虫基因技术，其特征在于：是以杨树优良品种欧美杨１０７（Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ ｃｌ．“７４／７６”）为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；试验选用的材料为：（１）、菌种和质粒：含Ｂｔ基因的植物表达载ｐＣＵＢＶｇｂ转化的根癌农杆菌ＬＢＡ ４４０４；（２）、植物材料：欧美杨１０７（Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ ｃｌ．“７４／７６”）；（３）、供试昆虫：榆毒蛾（Ｌｅｕｃｏｍａ ｃａｎｄｉｄａ Ｓｔａｕｄｉｎｄｅｒ）幼虫和天幕毛虫幼虫；（４）、主要化学试剂 ：Ｋｍ（卡那霉素）、Ｃｂ（羧苄青霉素）、Ｈｙｇ（潮霉素）、Ｒｉｆ（利福霉素）；ＰＣＲ扩增引物、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、ｂｕｆｆｅｃｒ、λＤＮＡ；（５）、培养基：（１）、农杆菌培养基（ＹＥＢ）蛋白胨（Ｐｅｐｔｏｎｅ）５ｇ／Ｌ；蔗糖（Ｓｕｃｒｏ ｓｅ）１ｇ／Ｌ；牛肉膏（Ｂｅｅｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／Ｌ；酵母提取物（（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．５ｇ／Ｌ；固体则加入１．４％琼脂，以１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ调ｐＨ值为７．２；（２）、植物组织培养基以ＭＳ为基本培养基，附加不同浓度激素，配置各种培养基：继代培养基：ＭＳ＋６－ＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ７ｍｇ／Ｌ；共培养培养基：茎段：ＭＳ＋６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０２ｍｇ／Ｌ；叶片：ＭＳ＋ ６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ；筛选分化培养基：茎段：ＭＳ＋６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０２ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ７ｍｇ／Ｌ＋２５０ｍｇ／ＬＣｂ；叶片：ＭＳ＋６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ ５ｍｇ ／Ｌ＋２５０ｍｇ／ＬＣｂ；生根培养基：ＭＳ＋０．０２ｍｇ／ＬＩＢＡ＋Ｈｙｇ ５ｍｇ／Ｌ＋Ｃｂ２５０ｍｇ／Ｌ；各培养基均含３％蔗糖和０．７％琼脂，ＰＨ值为５．８，抗生素抽滤灭菌，其它成分高压灭菌。...

【技术特征摘要】
1.一种杨树转抗虫基因技术，其特征在于是以杨树优良品种欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；试验选用的材料为(1)、菌种和质粒含Bt基因的植物表达载pCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404；(2)、植物材料欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)；(3)、供试昆虫榆毒蛾(Leucoma candida Staudinder)幼虫和天幕毛虫幼虫；(4)、主要化学试剂Km(卡那霉素)、Cb(羧苄青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR扩增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA(5)、培养基(1)、农杆菌培养基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏(Beet Extract)5g/L；酵母提取物((Yeast Extract)5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；固体则加入1.4％琼脂，以1mol/LNaOH调pH值为7.2；(2)、植物组织培养基以MS为基本培养基，附加不同浓度激素，配置各种培养基继代培养基MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；共培养培养基茎段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L；叶片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L；筛选分化培养基茎段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；叶片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg 5mg/L+250mg/LCb；生根培养基MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；各培养基均含3％蔗糖和0.7％琼脂，PH值为5.8，抗生素抽滤灭菌，其它成分高压灭菌；2.根据权利要求1所述的杨树转抗虫基因技术，其特征在于杨树转抗虫基因技术方法为(1)、潮霉素临界浓度的确定设计6个潮霉素的浓度梯度0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段，切成0.5cm大小，置于培养基中，一个月后观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；(2)、菌液的准备①、菌种的活化从甘油管中挑取含有植物植物表达载体的农杆菌菌液划线于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒温箱中，过夜培养形成单菌落；②、菌液的培养从平板上挑取农杆菌单菌落，接种于10mlYEB液体培养基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震荡培养过夜，次日早晨取过夜培养的菌液0.8～1ml加至20ml新鲜的不含抗生素的YEB液体培养基中，继续震荡培养3～5h，至菌液浓度OD600＝0.3～0.5时，8000rpm离心5min，沉淀用MS液悬浮，并稀释20～30倍即可用于转化(3)、叶盘法转化杨树利用叶盘法(Horsch，1985)对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，室温下不断摇动使外植体与菌液充分接触10min，取出后用无菌滤纸吸去表面多于的菌液，放入铺有一层滤纸的共培养培养基中，25℃下暗培养2～3d，然后转入选择分化培养基中培养；(4)、菌液浓度及侵染时间对转化效果的影响①、菌液浓度的影响取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD600值为0.1、0.3、0.5、0.8的农杆菌菌液中侵染10min，观察不同的菌液浓度对转化效果的影响；②、侵染时间的影响取杨树...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝全，
申请(专利权)人：辽宁生生生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]