转化效率更高的将基因导入植物的方法技术

一种产生转基因植物的方法，它包括：制备至少一个具有一个生长点的末端和不含生长点的基部的芽作为基因导入的组织；将所需的基因导入基部，同时保持至少一端的生长点分化成不定芽。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
转化效率更高的将基因导入植物的方法(1)专利
本专利技术涉及一种改善转化效率的方法，其中用基因工程技术将所需基因导入植物。(2)
技术介绍
通过使用基因工程技术将基因导入植物的方法，能直接将所需基因导入植物。因此，它与传统的重复杂交育种相比有许多优点。例如，通过基因导入，(a)可仅导入一种要改变的特征，(b)植物外其它物种(微生物等)的特征也可以导入到植物中，和(c)可显著减少育种期。然而，由于基因工程技术的转化效率低，由乔木的种类而定。有许多植物不能充分获得这些优点，例如，由于乔木的生命周期长，通过重复杂交进行的常规育种需要大量的土地和许多年。另外，乔木是最重要的生物质来源之一，近年来期望它能维持和改善地球环境，因此人们关注针对开发各种具有更卓越的性质的品种，这些性质包括生长率、环境抗性等。因此，虽然基因导入的直接育种也在乔木中产生了很大的进步，但工业上重要的树种中转化的效率在大多数情况下还是很低的。因此，为了转化这些乔木，已尝试通过各种观点的检测，例如用组织类型，基因导入处理的条件和在处理前后组织的培养条件，来提高转化效率。用芽(shoot)作为导入基因的组织进行基因导入的处理，从其重新分生出的不定芽来获得导入所需的导入基因的个体，即转化株，这种方法也已对树种进行了检测。然而，提高原来转化效率低的树种的效率也是困难的。毕竟事实上还未有通过基因工程技术获得品质改善到有实际价值水平的工业上重要的树种。另外，迄今为止，已建立的，如转化植物的制备法是这样的方法，根据所用不同的植物种类，通过确定基因导入处理条件、基因导入组织的培养条件等而建立起来，并且试图从个体上提高转化效率，而针对许多植物能同样提高转化效率的转化方法现在还是未知的。(3)
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种产生转基因植物的方法，其中通过用基因工程技术提高转化效率，而产生转基因植物，该方法用于多种植物，包括转化被认为是困难的乔木。本专利技术的这个和其它目的可用一种产生转基因植物的方法实现，它包括制备有至少一个具有生长点的末端，和不含生长点的基部的芽(shoot)作为导入基因的组织；和在基部导入所需的基因，同时维持至少一端中的生长点分化成不定芽(bud)。(4)附图说明图1是一张示意图，显示掺入pBI121载体中的植物基因内的T-DNA区的结构。图2是一张示意图，显示掺入pIPT10载体中的植物基因内的T-DNA区的结构。(5)具体实施方式作为深入研究的结果，本专利技术人发现了当用具有生长点的芽作为导入基因的组织，将所需基因导入芽的基部时，所需基因能有效导入基部的细胞，而且导入所需基因的芽的基部重新分化成所需的导入基因的不定芽的能力很强。因此，完成了本专利技术。本专利技术可用于任何植物，而不论其物种。然而，在被认为为导入基因困难的植物，例如乔木等中尤其能获得本专利技术的效果。在本专利技术中，用作导入基因的组织的芽意味着延长的定芽(bud)或不定芽。另外，为了进一步改善转化效率，优选用具有高重新分生能力的组织或部分，例如具有低浓度聚苯酚(使组织变黑)的嫩组织作为导入基因的组织。由此可见，在本专利技术中选择种子发芽获得的下胚轴和延伸的顶芽或在培养容器中培养的植株侧芽作为导入基因的合适组织。然而，该芽必需具有至少一个具有生长点的末端，和不含生长点的基部。例如，当用下胚轴作为作为本专利技术导入基因的组织时，可在种子发芽后通过从下胚轴切去根部和含有根基的部分，而留下顶芽和顶芽原基不动，获得芽。就此，具有生长点的一端意味着具有顶芽等的芽的一端，不含生长点的基部意味着通过切去根等形成的具有端面的部分。另外，当用植株的延伸的顶芽或侧芽作为本专利技术导入基因的组织，可以简单从植株上切下获得。就此，具有生长点的一端意味着具有顶芽等的芽末端，与下胚轴类似，而不含生长点的基部意味着具有从植株切下的端面的部分。即所需基因优选导入当制备芽作为基因导入的组织时，产生的芽的基部的端面。在本专利技术中，不定芽是通过在不含生长点的基部导入所需基因，同时保留至少一端的生长点分化而成的。作为所需的基因，可选择和使用各种基因，例如可提供工业上卓越性质的基因和不能总是提供工业上卓越的特征，但在研究基因表达机制中是必需的基因。可间接通过双粒病毒、雀麦草花叶病毒、根癌土壤杆菌(Agrobactriumtumefaciens)(此后称为(A.tumefaciens))、发根土壤杆菌(Agrobateriumrhizogenes)等病毒和细菌，通过将所需基因插入合适的载体，或直接用颗粒轰击法等(I.Potrykus，Annu.rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.，42205(1991))将所需基因导入芽基部。例如，在使用土壤杆菌(土壤杆菌法，例如EP-A-0290799，美国专利4,940,838和5,591,616等)的基因导入法中，将其中插入了所需基因的合适载体通过土壤杆菌感染导入组织，来导入基因。土壤杆菌的感染是通过例如将要导入基因的组织浸在悬浮土壤杆菌的溶液中进行的。另外，由于土壤杆菌的感染在植物组织的伤口中发生，当在基部形成伤口的芽浸在土壤杆菌悬液中时，伤口被土壤杆菌感染，所需基因导入芽基部。当下胚轴通过切去根等用作基因导入的组织，或通过将其从植株上切下使用延伸的顶芽等时，感染在切割形成的芽基部的端面(切面)发生。即在这些情况下，仅通过将要导入基因的组织简单浸在土壤杆菌悬液中就将所需的基因导入芽中。另外，当要导入基因的组织被浸在细胞悬液中，然后通过将组织置于固态培养基与土壤杆菌共培养数日，可肯定用土壤杆菌感染植物组织。作为培养基，可使用恰当补充了碳源和培养基固化剂，和如需要植物激素例如生长素、细胞分裂素等的熟知的基础培养基，例如MS(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15473-497(1962))或WPM(Loyd和McCown，Prop.Int.Plant Prop.Soc.，30421-427(1980))，或其改良的组合，来适合要被土壤杆菌感染的要导入基因的组织。就此，用10-30g/L蔗糖作为碳源；5-10g/L琼脂或1-4g/L琼脂糖胶作为培养基固化剂；0.01-5.0mg/L玉米素、苄基腺嘌呤等作为细胞分裂素，0.01-2.0mg/L萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸等作为生长素。另外，在某些情况下通过在上述共培养培养基中加入10-200mg/L乙酰丁香酮提高了土壤杆菌的感染力。在其它方面，当通过轰击枪导入所需基因时，可用上述共培养培养基作为导入基因处理的培养基。就此，导入基因的组织至于培养基上，以其要导入所需基因的位置，即芽基部向上，通过以常规方法操纵颗粒枪进行基因导入。一般当所需基因导入要导入基因的组织时，可选择标记基因与所需基因一起导入，并用可选择标记基因的表达作为导入所需基因的标记。在本专利技术的方法中，还可用细胞分裂素相关基因作为可选择标记基因改善转化效率。本文中细胞分裂素相关的基因是一个基因，它起到指导导入的植物细胞中细胞分裂素的影响增强，从而提高细胞的不定芽分化能力的作用。基因的例子包括作为根癌土壤杆菌-衍生的细胞分裂素合成基因(A.C.Smigocki和L d.Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生转基因植物的方法，其特征在于，该方法包括：制备有至少一个具有生长点的末端，和不含生长点的基部的芽作为基因导入的组织；和在基部导入所需的基因，同时维持至少一端中的生长点分化成不定芽。

【技术特征摘要】
JP 2001-7-24 2001-2236641.一种产生转基因植物的方法，其特征在于，该方法包括制备有至少一个具有生长点的末端，和不含生长点的基部的芽作为基因导入的组织；和在基部导入所需的基因，同时维持至少一端中的生长点分化成不定芽。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该芽是桉属的芽。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该芽是具有顶芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：松永悦子，杉田耕一，海老沼宏安，
申请(专利权)人：日本制纸株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]