一种检测阪崎克罗诺杆菌的制造技术

本发明专利技术本发明专利技术属于分子生物学应用技术领域，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的

【技术实现步骤摘要】
一种检测阪崎克罗诺杆菌的LMTIA引物对、试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于分子生物学应用
，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的
LMTIA
引物对
、
试剂盒和方法
。

技术介绍

[0002]克罗诺杆菌
(Cronobacter spp.)
广泛存在于婴幼儿奶粉米粉
、
肉类
、
饮用水和蔬菜中，可引起菌血症
、
脑膜炎
、
坏死性小肠结肠炎等疾病
。
阪崎克罗诺杆菌
(Cronobacter sakazaki i)
是克罗诺杆菌的一种，也是最常见的致病类型
。
婴幼儿是该菌感染的高危人群，一旦引发相关疾病，致死率最高可达
80
％
。
阪崎克罗诺杆菌具有较强的增殖能力，对环境因素有较强的抗逆性，具有较高的耐热
、
耐酸碱和极强的耐干燥特性，容易对食品安全造成较大的危害性
。
阪崎克罗诺杆菌致病原因复杂，目前学界尚未探明阪崎克罗诺杆菌因何原因致婴幼儿人群感染严重疾病
。
基于此，只能将阪崎克罗诺杆菌作为一项食品安全重点检测内容
。
[0003]阪崎克罗诺杆菌核酸检测的方法多为
PCR、RPA、LAMP
等方法，且存在靶基因种类少
、
特异性不强的问题
。
现有阪崎克罗诺杆菌的检测技术一般针对
>α
‑
葡萄糖苷酶
(gluA)
基因
、
外膜蛋白
A(ompA)
基因
、16S rRNA
基因等
。
阪崎克罗诺杆菌型别多，基因变异多，有必要挖掘新的特异靶基因，提升检测技术的特异性和普适性
。
[0004]LMTIA
技术即梯型熔解温度等温扩增
(ladder
‑
type melting temperature isothermal amplifi cation,LMTIA)
技术，是
2021
年开发的一种新型核酸等温扩增技术
。
该技术在
LAMP
和
PC R
的基础上进行改进，
LMTIA
的最大优点是利用引物与靶序列的熔解温度
(Tm)
差实现了聚合酶链式反应的等温反应
。
基层部门使用水浴锅即可进行
LMTIA
扩增反应，设备需求简单
。
此外
LMTIA
解决了现有
LAMP
技术存在的反应时间长
、
非特异性扩增等缺点，具有反应时间短
、
特异性强
、
灵敏度高等优点
。LMTIA
技术虽然比
LAMP
和
PCR
更为先进快捷，但因为该技术研发时间较短，目前尚未在学界普及
。LMTIA
技术难点在于靶序列选择和引物设计，采用该技术进行食源性致病菌的快速检测的研究很少见相关报道
。

技术实现思路

[0005]基于现有阪崎克罗诺杆菌的检测技术一般针对
α
‑
葡萄糖苷酶
(gluA)
基因
、
外膜蛋白
A(om pA)
基因
、16S rRNA
基因等，而阪崎克罗诺杆菌型别多，基因变异多，有必要挖掘新的特异靶基因，提升检测技术的特异性和普适性的技术问题
。
本专利技术的第一个目的在于提供一种特异性强的检测阪崎克罗诺杆菌的新靶标
。
[0006]本专利技术基于比较基因组学系统地分析了阪崎克罗诺杆菌的特异基因，挖掘出新靶标糖基水解酶基因
mngB
，并根据
LMTIA
靶序列选择标准，筛选出了该基因中的一段核苷酸序列
(
靶基因片段
)
应用在检测阪崎克罗诺杆菌中，该靶基因片段的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0007]专利技术人发现，
NCBI
数据库中的所有阪崎克罗诺杆菌的二代
、
三代全基因组测序菌
株
mn gB
都具有较高的同源性
。
阪崎克罗诺杆菌不同菌株
ompA
基因序列相似性最低只有
96
％左右，
gluA
基因序列相似性最低只有
97
％左右，阪崎克罗诺杆菌不同菌株
mngB
基因序列相似性最低可达
98
％左右
。
相比
ompA、gluA
基因而言，阪崎克罗诺杆菌不同菌株
mngB
同源性更高，因此本专利技术的方法在鉴别区分阪崎克罗诺杆菌上有优良的广谱性
。
[0008]此外，阪崎克罗诺杆菌的
mngB
基因与其他近缘细菌如苏黎世克罗诺杆菌
(C.turicensis)、
丙二酸盐克罗诺杆菌
(C.malonaticus)
同源性很低
。
阪崎克罗诺杆菌的
ompA、gluA
基因与其他近缘细菌同源性较高
。
本专利技术基于该靶基因片段的检测方法相比于传统方法中常用的靶基因
ompA、gluA
基因具有更强的特异性，在鉴别区分阪崎克罗诺杆菌与其近缘物种上有优良的特异性
。
[0009]基于上述新靶标的靶基因片段，本专利技术的第二个目的在于提供一种检测阪崎克罗诺杆菌的
LMTIA
引物对，引物对根据上述的靶基因片段设计得到，包括上游引物
mngB
‑
F
和下游引物
mngB
‑
R
，上游引物
mngB
‑
F
的序列如
SEQ ID NO.2
所示，下游引物
mngB
‑
R
的序列如
SEQ ID NO.3
所示
。LMTIA
技术难点在于靶序列选择和引物设计，采用该技术进行食源性致病菌的快速检测的研究很少见相关报道，而本专利技术通过专利技术人的研究创新进而提出的上述针对阪崎克罗诺杆菌的
LMTIA
检测的新靶标和
LMTIA
引物对则很好的克服了这一行业技术难题
。
[0010]上述引物对可以应用于制备阪崎克罗诺杆菌的鉴别试剂和试剂盒中，基于此，本专利技术的三个目的在于提供一种提供准确
、
快速
、
特异性强
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
靶基因片段在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，其特征在于，所述靶基因片段的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
一种检测阪崎克罗诺杆菌的
LMTIA
引物对，其特征在于，所述引物对根据权利要求1所述的靶基因片段设计得到，包括上游引物
mngB
‑1和下游引物
mngB
‑2，所述上游引物
mng B
‑1的序列如
SEQ ID NO.2
所示，所述下游引物
mngB
‑2的序列如
SEQ ID NO.3
所示
。3.
权利要求2所述的
LMTIA
引物对在制备非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒或鉴别试剂中的应用
。4.
一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的
LMTIA
引物对
。5.
根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括
Bst 4.0HNB Bead
和
ddH2O。6.
一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求2所述的
LMTIA
引物对对待测样品
...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟平平，李睿，吴鑫，朱应飞，曾驰，刘中华，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：