一种猪血凝性脑脊髓炎病毒结合蛋白及制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种猪血凝性脑脊髓炎病毒结合蛋白及制备方法，通过构建噬菌体文库的方法来制备一种与猪血凝性脑脊髓炎病毒相结合的蛋白，这种结合蛋白具有阻断猪血凝性脑脊髓炎病毒感染神经细胞的作用，达到抗病毒效果，目标具有针对性，可解决因病毒变异带来的现有疫苗和药物失效的问题，是一种全新机制的抗猪血凝性脑脊髓炎病毒药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种猪血凝性脑脊髓炎病毒相结合蛋白，同时还公开了该病毒结合蛋 白的制备方法，并利用病毒结合蛋白制备防治猪血凝性脑脊髓炎病毒的药物，属于生物技 术领域。
技术介绍
(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis) ifirt 性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus，以下简称HEV)引起仔猪 的一种急性、高度接触性传染病。HEV属于冠状病毒属的成员，其主要侵害1 3周龄的仔 猪，临床上以仔猪呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征，死亡率高达20 100%。国内 外学者的血清学调查发现，猪的HEV感染非常普遍，呈世界性分布，对养猪业发展已构成严 重威胁。但HEV病毒是如何感染机体的，目前还不清楚，正是由于其感染机制不清楚，所以 在该病的防治方面还缺乏有效的手段。到目前为止尚未有研究报道HEV病毒的细胞受体。 为了更好地防治该病，或者从根本上彻底消除该病，对其细胞受体的研究显得尤为重要。随着现代研究手段的进步，近年来有关病毒受体的研究已有较大进展，部分病毒 受体的结构和功能已在不同程度上得到确认。绝大多数受体的本质是蛋白，所以研究蛋白 相互作用的方法都可用来研究受体。通常用病毒敏感细胞构建cDNA文库筛选受体蛋白，这 是一种既经典又在不断发展的方法。易感细胞的易感性来源于细胞内编码受体蛋白基因的 表达，建立所有表达基因的cDNA文库，采用适当的方法筛选cDNA文库，则可直接找到编码 受体蛋白的基因。经检索相关文献，目前国内外还没有关于猪血凝性脑脊髓炎病毒结合蛋白及其应 用的报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种猪血凝性脑脊髓炎病毒相结合蛋白，为一种新的结合蛋白。本专利技术进一步提供了上述结合蛋白的制备方法，适用于工业化生产。本专利技术还公开了上述结合蛋白在制备治疗猪血凝性脑脊髓炎药物中的用途。本专利技术的猪血凝性脑脊髓炎病毒相结合蛋白，具有与猪血凝性脑脊髓炎病毒相结 合的特征，其蛋白氨基酸序列如下mfgglsswlg lkppegaaae geeppsrdgd klsagaapse esperpvept eeqqqqpptedpqflhqakg lgnylynfas aatkkitesv tetaqtikks veegkiddil dktilgdfqkeqkkfveeqn tkkseaavpp wveshdeeti qqqilalsad krnflrdppa gvqfnfdfdqmypvalvmlq edellskmrf alvpklvkee vfwrnyfyri slikqsaqlt alaaqqqasgkeekssnrdd nlplteavrp ktppvviksq lksqedeeei stspgvsefv sdafdtcslnqedlrkemeq lvldkkqeea taleedstdw ekelqqelqe yevvaesekr denwdkeiekmlqes本专利技术所述结合蛋白的制备方法，包括以下步骤利用原代培养的小鼠神经细胞构建T7噬菌体展示文库，利用纯化的猪血凝性脑 脊髓炎病毒的S蛋白来筛选文库，获得与猪血凝性脑脊髓炎病毒相结合蛋白。本专利技术所述结合蛋白的制备方法，具体步骤如下1)原代小鼠神经细胞的培养；2)构建小鼠神经细胞T7噬菌体展示文库；3)用真核表达的重组猪血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白对文库进行筛选；4)对筛选获得的片段进行基因序列测定与分析；5)将筛选获得的插入片段测序，获得结合蛋白。本专利技术所述的结合蛋白在制备防治猪血凝性脑脊髓炎药物中的用途。以下实验表明本结合蛋白在阻断HEV感染小鼠神经细胞的作用用细胞阻断试验检测实施例1制备的结合蛋白的抗体对HEV感染的影响。试验组 共接4个重复细胞孔，每孔加2%牛血清1640 200uL+Syapl兔多抗20 y L ；对照组共接4 个重复细胞孔，每孔加2%牛血清1640 200 iiL。然后在37°C、5% C02温箱中培养2h后， 移去各孔中的培养液，用O.Olmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)彻底清洗各细胞培养孔。试验 组和对照组每孔加2%牛血清1640 200 u L+HEV 20 y L (病毒血凝效价达26)，病毒吸附lh 后，每孔再加10%牛血清1640培养基lmL继续培养。每隔12h，收集各细胞培养孔中的上 清液，应用血凝实验检测细胞培养上清液中的HEV增殖水平。结果结合蛋白抗体可以有效地阻断HEV对小鼠神经细胞感染。结论由以上结果可以看出，通过用猪血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白来筛选小鼠神 经细胞T7噬菌体展示文库，获得一种与猪血凝性脑脊髓炎病毒相互作用的蛋白即突触相 关蛋白1。突触相关蛋白1的抗体可阻断病毒感染小鼠神经细胞。猪血凝性脑脊髓炎病毒 S蛋白是一个潜在有效的抗病毒药物靶标，特异性抑制HEV感染的突触相关蛋白1及其异构 体具有制备抗HEV病毒药物的应用前景，可克服病毒变异，其抗病毒靶标单一，作用位点更 确切，可开发为一类新型猪血凝性脑脊髓炎病毒药物。本专利技术的积极效果在于通过构建噬菌体文库的方法来制备一种与猪血凝性脑脊 髓炎病毒相结合的蛋白，这种结合蛋白具有阻断猪血凝性脑脊髓炎病毒感染神经细胞的作 用，达到抗病毒效果，目标具有针对性，可解决因病毒变异带来的现有疫苗和药物失效的问 题，是一种全新机制的抗猪血凝性脑脊髓炎病毒药物。附图说明图1、原代培养6天的小鼠神经细胞；图2、小鼠神经细胞T7噬菌体展示文库PCR鉴定；图3、文库经S蛋白5轮筛选后获得的插入片段PCR鉴定；图4、流式细胞术检测猪血凝性脑脊髓炎病毒在小鼠神经细胞内增殖；图5、流式细胞术检测结合蛋白抗体阻断猪血凝性脑脊髓炎病毒感染小鼠神经细 胞；图6、流式细胞术检测阴性对照。具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术。下面用实 施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1利用原代培养的小鼠神经细胞构建T7噬菌体展示文库1、原代培养小鼠神经细胞取出生后1 3d的新生小鼠，乙醇消毒，断颈处死后，用眼科镊剥出整个大脑组 织，在用眼科剪将大脑皮质剪成小组织块，然后加入0. 25%胰蛋白酶，37°C恒温箱中消化 lOmin。消化完全后用含10% FBS的DMEM培养液终止消化，静置5min后收集上层细胞悬液。 将细胞悬液过70iim Zellsieb网筛后，用含10% FBS的DMEM培养液重悬，细胞计数后，接 种细胞于预先涂布有多聚赖氨酸的12孔培养板内，培养液加青、链霉素(各100U/mL)，置 37°C,5% C02培养箱内培养。12 24h后用含F12的10% FBS的DMEM培养液给细胞全量 换液，以后每3d半量换液1次，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。结果见图1原代培养的神经细胞具有神经细胞结构的典型特征，包括胞体、树突 和轴突。细胞间网络密集，轮廓清晰，立体感强，轴树突相互交织成网。2、小鼠神经细胞T7噬菌体展示文库的构建首先用Trizol 提取小鼠神经细胞总 RNA，用 Poly (A) Quick mRNA Isolation Kit 提纯 mRNA。用 OrientExpress Random Prim本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合蛋白，具有与猪血凝性脑脊髓炎病毒相结合的特征，其蛋白氨基酸序列如下：　　ｍｆｇｇｌｓｓｗｌｇ　ｌｋｐｐｅｇａａａｅ　ｇｅｅｐｐｓｒｄｇｄ　ｋｌｓａｇａａｐｓｅ　ｅｓｐｅｒｐｖｅｐｔ　ｅｅｑｑｑｑｐｐｔｅ　　ｄｐｑｆｌｈｑａｋｇ　ｌｇｎｙｌｙｎｆａｓ　ａａｔｋｋｉｔｅｓｖ　ｔｅｔａｑｔｉｋｋｓ　ｖｅｅｇｋｉｄｄｉｌ　ｄｋｔｉｌｇｄｆｑｋ　　ｅｑｋｋｆｖｅｅｑｎ　ｔｋｋｓｅａａｖｐｐ　ｗｖｅｓｈｄｅｅｔｉ　ｑｑｑｉｌａｌｓａｄ　ｋｒｎｆｌｒｄｐｐａ　ｇｖｑｆｎｆｄｆｄｑｍｙｐｖａｌｖｍｌｑ　ｅｄｅｌｌｓｋｍｒｆ　ａｌｖｐｋｌｖｋｅｅ　ｖｆｗｒｎｙｆｙｒｉ　ｓｌｉｋｑｓａｑｌｔ　ａｌａａｑｑｑａｓｇ　　ｋｅｅｋｓｓｎｒｄｄ　ｎｌｐｌｔｅａｖｒｐ　ｋｔｐｐｖｖｉｋｓｑ　ｌｋｓｑｅｄｅｅｅｉ　ｓｔｓｐｇｖｓｅｆｖ　ｓｄａｆｄｔｃｓｌｎ　　ｑｅｄｌｒｋｅｍｅｑ　ｌｖｌｄｋｋｑｅｅａ　ｔａｌｅｅｄｓｔｄｗ　ｅｋｅｌｑｑｅｌｑｅ　ｙｅｖｖａｅｓｅｋｒ　ｄｅｎｗｄｋｅｉｅｋ　　ｍｌｑｅｓ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高巍，高丰，杜崇涛，贺文琦，陆慧君，宋德光，任文陟，陈克研，兰云刚，解胜男，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]