一锅法滚环转录和制造技术

本发明专利技术公开了一锅法滚环转录和

【技术实现步骤摘要】
一锅法滚环转录和CRISPR/Cas介导的核酸检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学核酸快速检测领域，具体涉及一种一锅法滚环转录和 CRISPR/Cas
介导的核酸检测方法及试剂盒
。
尤其涉及一种新的核酸等温扩增与信号输出一体化检测技术，利用
DNA
连接酶，
RNA
聚合酶和
CRISPR/Cas
蛋白在常温等温条件下，可快速
、
一步
、
单管完成特定
DNA
或者
RNA
的扩增和检测
。

技术介绍

[0002]荧光定量聚合酶链反应
(qPCR)
是目前核酸分子诊断的金标准
。
与脱氧核糖核酸
(DNA)
检测不同的是，核糖核酸
(RNA)
的体外诊断往往需要分为两个分步骤：
(1) 在逆转录酶的作用下将
RNA
逆转录成
cDNA
；
(2)
对
cDNA
样本进行
qPCR
扩增和检测分析
。
虽然，
qPCR
是非常成熟的一门技术并已广泛应用于医学诊断，但它仍需要大型且昂贵的热循环仪
、
样本的运输与保存
、
专业的操作人员和检测时间过长
(
从样本到结果，至少需要2‑4小时
)
，这在很大程度上限制了
qPCR
在资源有限环境和即时监测 (POC)
分析中的应用
。
[0003]核酸等温扩增技术已经成为一种有前途的替代方法，它可以在恒温条件下实现目标核酸分子的快速
、
高效扩增，而无需
qPCR
所需的热循环仪
。
此外，等温扩增可以在简单的条件下进行，如室温，水浴锅等，尤其是用于资源有限的地区核酸分子的快速检测具有得天独厚的优势，这是
qPCR
无法比拟的
。
自
20
世纪
90
年代初以来，数十种等温核酸扩增技术被开发出来，其中有些已经商业化，例如环介导等温扩增
(LAMP)
技术
, 它是一种利用4‑6对引物识别靶标特异的位点，在
60
‑
65℃
下，利用链置换酶活性的
DNA 聚合酶实现核酸的高效
(1
小时以内
)
扩增检测
。
重组酶聚合酶扩增
(RPA)
技术，是在恒温
37
‑
42℃
条件下，模拟体内核酸复制机制，由多种关键酶或蛋白协助
DNA
聚合酶扩增实现核酸的指数扩增技术，整个反应一般需要
20
‑
30
分钟
。
基于核酸序列的扩增 (NASBA)
技术，利用逆转录酶，
T7 RNA
聚合酶和
RNase H
以及两个寡核苷酸引物，在
41℃
左右实现对
RNA
的快速和持续扩增
(60
分钟左右
)。
滚环扩增
(RCA)
技术，利用
DNA
连接酶和链置换活性的
DNA
聚合酶，在
30℃
下，一条或多条引物的引导下进行环形模板的链置换，产生多条具有靶标序列的重复长单链，整个过程一般在2小时左右
。
[0004]然而，以上几种等温扩增技术都存在各自的不足，如
LAMP
法扩增，需要的引物较多
(4
‑6条
)
，对引物设计要求比较高，对于点突变或修饰位点的检测常常不能满足要求
。
经
LAMP
扩增后的产物在开盖的情况下极易形成气溶胶污染，从而导致产生假阳性结果
。RPA
法的酶组分较为复杂，对缓冲液的要求较高，反应体系的稳定性不强，易造成重复性不好，此外，它也无法对突变位点进行检测
。
同时，
LAMP
和
RPA
对于
RNA 样本检测仍需要逆转录
。NASBA
法对
DNA
的检测不太适合，反应成分比较复杂且稳定性较差，易受基质的影响
。RCA
法的反应时间偏长，在现场检测中的优势不太明显
。
滚环转录
(RCT)
是一种具有体外转录活性的
RNA
聚合酶催化的等温扩增反应
。
在目标核酸分子的一条链与单链
DNA
探针杂交后在
DNA
连接酶的作用下连接成环状模板，在
RNA
聚合酶的作用下沿着环状模板持续转录为含靶标序列的重复长单链
RNA
产物，实现常温下的高效扩增
。
但对于扩增单链
RNA
的产物的检测缺
乏有效和特异性的方法
。
[0005]CRISPR(
成簇的规律间隔的短回文重复序列
)
系统是细菌或者古生菌进化出来用以抵御病毒感染的免疫系统，它能够识别外来的遗传物质并且将其整合到自身基因组的 CRISPR
序列中，当外来遗传物质再次侵入时，通过
Cas
核酸酶精准剪切外源核酸
。Cas 核酸酶是
CRISPR
中一种重要的相关蛋白，
Cas13a
是近年来新鉴定到一种
CRISPR
核酸酶，这个核酸酶具有能被特异性
RNA
激活获得非特异性的
RNA
核酸酶的活性，从而切割其它单链
RNA
，配合
RNA
荧光报告系统能够检测特异性的
RNA
产物，但
Cas13a
单独作用时灵敏度较低，只能实现
fM
到
pM
级别的核酸检测，对于分子诊断的灵敏度欠佳，如在不进行核酸扩增的情况下直接检测潜在肿瘤标志物
miR
‑
19b
和
miR
‑
20a
，检出限为
10pM。2017
年和
2019
年，张锋等利用
Cas13a
蛋白结合等温扩增技术
RPA
，开发了可以检测核酸的新方法
SHERLOCK
，其灵敏度可以实现对
aM
级样品的检测
。
但 SHERLOCK
方法对于
RNA
检测无法实现一步单管的检测，且
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
PROTRACTOR
等温核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、
从待检测样本中提取总核酸；
S2、
配置反应体系，所述反应体系包括单链
DNA
探针
、RNA
荧光探针
、DNA
连接酶或其变体
、RNA
聚合酶或其变体
、
向导
RNA
或其衍生物
、CRISPR
相关
Cas
蛋白或其变体
、PROTRACTOR
反应缓冲液；其中单链
DNA
探针与目标核酸分子的一条链特异性的互补；
S3、
将步骤
S1
提取的总核酸加入步骤
S2
的反应体系中，进行恒温反应，并产生荧光信号；恒温反应过程中，单链
DNA
探针在
DNA
连接酶或其变体作用下形成单链环状
DNA
探针；
S4、
读取和记录
PROTRACTOR
产生荧光信号，通过荧光信号来判断待检测样本中目标核酸分子的有无
。2.
如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述
PROTRACTOR
为普适性核酸检测平台，能检测不同类型的核酸分子，包括单链
DNA、
双链
DNA、
单链
RNA
中的一种或几种
。3.
如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述
CRISPR
相关
Cas
蛋白或其变体为具有单链
RNA
识别剪切功能和反式
RNA
单链剪切功能的核酸酶；所述
CRISPR
相关
Cas
蛋白或其变体包括
LbaCas13、LbuC13a、LwaCas13a、AspCas13b、BzoCas13b、CcaCas13b、PsmCas13b、PinCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PbuCas13b、PguCas13b、PigCas13b、PsaCas13b、RanCas13b、PspCas13b、EsCas13d、RspCas13d
中的任意一种或任意一种的变体
。4.
如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述单链
DNA
探针由
5'
端臂，连接序列和
3'
端臂三部分串联而成；
5'
端和
3'
端臂的序列均与目标核酸分子序列的一条链互补；连接序列是一段包含
T7
启动子互补序列
(T7p)
的
DNA
序列

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立桃，郭永坤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：