细胞穿透肽缀合物及其使用方法技术

公开了寡核苷酸和肽的缀合物，所述肽与所述寡核苷酸共价键合或通过接头连接，所述肽包括至少一个包含至少4个氨基酸残基的阳离子结构域和至少一个包含至少3个氨基酸残基的疏水性结构域，条件是所述肽总共包含7至

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞穿透肽缀合物及其使用方法


[0001]本专利技术涉及反义寡核苷酸的肽缀合物
、
含有它们的组合物以及它们的使用方法
。

技术介绍

[0002]核酸药物是能够改变人类医疗保健的基因组药物
。
研究表明，此类疗法可能在包括神经肌肉疾病的广泛疾病领域中得到应用
。
基于反义寡核苷酸的方法在神经肌肉疾病杜氏肌营养不良症
(DMD)
中调节前
mRNA
剪接的应用已将这种单基因疾病置于精准医疗发展的前沿
。
[0003]但是，细胞渗透性不足和分布特性差阻碍了这些有前途的反义疗法的治疗发展
‑
DMD
中肌肉组织基质的大体积和分散性质进一步凸显了这一挑战
。
[0004]每
3500
个新生男孩中就会有一个受到
DMD
影响
。
这种严重的
X
连锁隐性疾病是由编码肌营养不良蛋白的
DMD
基因突变引起的
。
该疾病的特征在于进行性肌肉变性和消耗，伴随呼吸衰竭和心脏并发症的出现，最终导致过早死亡
。DMD
背后的大多数突变是基因组框架外缺失，它们会在开放阅读框中引起过早的截短，从而导致肌营养不良蛋白的缺失
。
[0005]外显子跳过疗法利用剪接转换反义寡核苷酸
(SSO)
靶向
DMD
转录物的特定区域，诱导排除单个外显子，导致异常阅读框的恢复，并导致产生内部缺失但具有部分功能的肌营养不良蛋白
。
尽管针对
DMD
的反义寡核苷酸外显子跳跃疗法无疑具有潜力，但该方法的成功应用目前受限于骨骼肌的靶向效率相对较低，以及单链寡核苷酸无法充分靶向其他受影响的组织
(
例如心脏
)。2016
年9月，美国食品药品监督管理局
(FDA)
批准了对“eteplirsen”的加速审批，其是一种外显子
51
剪接的调节剂
。
尽管这预示着第一个美国
FDA
批准的调节剪接的寡核苷酸，但肌营养不良蛋白的恢复水平却令人失望，约1％的正常肌营养不良蛋白水平
。
与等位基因病症贝克肌营养不良症的比较以及在
mdx
小鼠中进行的实验表明，需要至少
‑
15
％野生型的同质肌膜肌营养不良蛋白表达来保护肌肉免受运动引起的损伤
。
[0006]因此，需要新的基于反义寡核苷酸的疗法来治疗
DMD
等毁灭性遗传疾病
。

技术实现思路

[0007]一般而言，本专利技术提供了寡核苷酸和肽的缀合物或其药学上可接受的盐，所述肽与所述寡核苷酸共价键合或通过接头共价连接
。
所述寡核苷酸与人肌营养不良蛋白基因的外显子
45、
外显子
51
或外显子
53
内或附近的靶序列互补
。
[0008]一方面，本专利技术提供了寡核苷酸和肽的缀合物或其药学上可接受的盐，所述肽与所述寡核苷酸共价键合或通过接头共价连接，
[0009]所述肽包含至少一个包含至少4个氨基酸残基的阳离子结构域和至少一个包含至少3个氨基酸残基的疏水性结构域，条件是所述肽包含总共7至
40
个氨基酸残基并且不包含任何人工氨基酸酸残基；并且
[0010]所述寡核苷酸包括总共
12
至
40
个连续核碱基，其中至少
12
个连续核碱基与人肌营养不良蛋白基因中的靶序列互补
。
[0011]在一些实施方案中，所述靶序列包括外显子
45
的剪接位点或位于外显子
45
的剪接位点的
50
个核碱基内
。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括来自表1中的任一序列及其胸腺嘧啶取代形式的至少
12
个连续核碱基
。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括表1中的任一序列或其胸腺嘧啶取代形式
。
[0012]在一些实施方案中，表1中的序列是：
[0013]5′‑
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA
‑3′
(SEQ ID NO:193)。
[0014]在一些实施方案中，表1中的序列是：
[0015]5′‑
CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG
‑3′
(SEQ ID NO:194)。
[0016]在一些实施方案中，所述靶序列包括外显子
51
的剪接位点或位于外显子
51
的剪接位点的
50
个核碱基内
。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括来自表2中的任一序列的至少
12
个连续核碱基及其胸腺嘧啶取代形式
。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括表3中的任一序列或其胸腺嘧啶取代形式
。
[0017]在一些实施方案中，表2中的序列是：
[0018]5′‑
CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG
‑3′
(SEQ ID NO:130)。
[0019]在一些实施方案中，表2中的序列是：
[0020]5′‑
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG
‑3′
(SEQ ID NO:195)。
[0021]在一些实施方案中，所述靶序列包括外显子
53
的剪接位点或位于外显子
53
的剪接位点的
50
个核碱基内
。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括来自表3中的任一序列的至少
12
个连续核碱基
。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括表3中的任一序列
。
[0022]在一些实施方案中，表3中的序列是：
[0023]5′‑
CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT
‑3′
(SEQ ID NO:162)。
[0024]在一些实施方案中，表3中的序列是：
[0025]5′‑
GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC
‑3′
(SEQ ID NO:171)。
[0026]在一些实施方案中，所述剪接位点是受体剪接位点
。
在一些实施方案中，所述剪接位点是供体剪接位点
。
[0027]在一些实施方案中，所述序列是
GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(SEQ ID NO:90)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】ID NO:90)。20.
根据权利要求1至
18
的任一项所述的缀合物，其中所述肽不包含氨基己酸
(X)
残基，或所述肽不包含6‑
氨基己酸残基
。21.
根据权利要求1至
18
的任一项所述的缀合物，其中所述肽由天然氨基酸残基组成
。22.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域的长度为4至
12
个氨基酸残基，优选为4至7个氨基酸残基
。23.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含至少
40
％
、
至少
45
％
、
至少
50
％的阳离子氨基酸
。24.
根据权利要求1至
26
的任一项所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含大部分阳离子氨基酸，优选地包含至少
55
％
、
至少
60
％
、
至少
65
％
、
至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％的阳离子氨基酸
。25.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含精氨酸
、
组氨酸
、
β
‑
丙氨酸
、
羟脯氨酸和
/
或丝氨酸残基，优选地其中每个阳离子结构域由精氨酸
、
组氨酸
、
β
‑
丙氨酸
、
羟脯氨酸和
/
或丝氨酸残基组成
。26.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域富含精氨酸和
/
或富含组氨酸，优选地每个阳离子结构域包含至少
40
％
、
至少
45
％
、
至少
50
％
、
至少
55
％
、
至少
60
％
、
至少
60
％
、
至少
65
％
、
至少
70
％的精氨酸和
/
或组氨酸残基
。27.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述肽包含两个阳离子结构域
。28.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含以下序列之一：
RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQ ID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)
或其任意组合；优选地，其中每个阳离子结构域由以下序列之一组成：
RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQ ID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)
或其任意组合
。29.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个疏水性结构域的长度为3‑6个氨基酸，优选地每个疏水性结构域的长度为5个氨基酸
。30.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个疏水性结构域包含大部分疏水性氨基酸残基，优选地每个疏水性结构域包含至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、100
％的疏水性氨基酸
。31.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个疏水性结构域包含苯丙氨酸
、
亮氨酸
、
异亮氨酸
、
酪氨酸
、
色氨酸
、
脯氨酸和谷氨酰胺残基；优选地其中每个疏水性结构域由苯丙氨酸
、
亮氨酸
、
异亮氨酸
、
酪氨酸
、
色氨酸
、
脯氨酸和
/
或谷氨酰胺残基组成
。
32.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述肽包含一个疏水性结构域
。33.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述或每个疏水性结构域包含以下序列之一：
YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQ ID NO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)、WWPW(SEQ ID NO:26)
或其任意组合；优选地，其中所述或每个疏水性结构域由以下序列之一组成：
YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQ ID NO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)、WWPW(SEQ ID NO:26)
或其任意组合
。34.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述肽由两个阳离子结构域和一个疏水性结构域组成，优选地，其中所述肽由侧接有两个阳离子臂结构域的一个疏水性核心结构域组成
。35.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述肽由一个疏水性核心结构域组成，所述疏水性核心结构域包含选自以下的序列：
YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQ ID NO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)
和
WWPW(SEQ ID NO:26)
，所述疏水性核心结构域侧接有两个阳离子臂结构域，每个阳离子臂结构域包含选自以下的序列：
RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQ ID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)
和
R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)。36.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述肽由以下序列之一组成：
RBRRBRRFQILYRBRBR(SEQ ID NO:27)、RBRRBRRYQFLIRBRBR(SEQ ID NO:31)、RBRRBRRILFQYRBRBR(SEQ ID NO:32)、RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)、RBRRBRRFQILYHBHBR(SEQ ID NO:38)、RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)。37.
根据权利要求1至
18
的任一项所述的缀合物，其中所述肽具有以下氨基酸序列
RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)。38.
根据权利要求1至
18
的任一项所述的缀合物，其中所述肽具有以下氨基酸序列
RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)。39.
根据权利要求1至
18
的任一项所述的缀合物，其中所述肽具有以下氨基酸序列
RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)。40.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述肽通过其
N
末端与缀合物的其余部分结合
。41.
根据权利要求
40
所述的缀合物，所述肽的
C
‑
末端是
‑
NH2。42.
根据权利要求1至
39
的任一项所述的缀合物，其中所述肽通过其
C
末端与缀合物的其余部分结合
。43.
根据权利要求
42
所述的缀合物，其中所述肽在其
N
末端被酰化
。44.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中所述缀合物为以下结构：
[
肽
]
‑
[
接头
]
‑
[
寡核苷酸
]。
45.
根据权利要求1至
43
的任一项所述的缀合物，其中所述缀合物为以下结构：
46.
根据权利要求1至
43
的任一项所述的缀合物，其中所述缀合物为以下结构：
[
肽
]
‑
[
接头
]
‑
[
肽
]
‑
[
接头
]
‑
[
寡核苷酸
]。47.
根据前述任一权利要求所述的缀合物，其中每个接头独立地为式
(I)
：
T1‑
(CR1R2)
n
‑
T2.(I)
其中
T1是用于连接肽的二价基团并且选自由
‑
NH
‑
和羰基组成的组；
T2是用于连接寡核苷酸的二价基团并且选自由
‑
NH
‑
和羰基组成的组；
n
为
1、2
或3；每个
R1独立地为
‑
Y1‑
X1‑
Z1,
其中
Y1不存在或是
‑
(CR
A1
R
A2
)
m
‑
，其中
m
是
1、2、3
或4，并且
R
A1
和
R
A2
各自独立地为氢
、OH
或
(1
‑
2C)
烷基；
X1不存在或是
‑
O
‑
、
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)O
‑
、
‑
OC(O)
‑
、
‑
CH(OR
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
C(O)
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
C(O)O
‑
、
‑
C(O)
‑
N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)C(O)N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)C(NR
A3
)N(R
A3
)
‑
、
‑
SO
‑
、
‑
S
‑‑
SO2
‑
、
‑
S(O)2N(R
A3
)
‑
、
或
‑
N(R
A3
)SO2‑
，其中每个
R
A3
独立地选自氢和甲基；并且
Z
l
是另外的寡核苷酸或者是氢
、(1
‑
6C)
烷基
、(2
‑
6C)
烯基
、(2
‑
6C)
炔基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基
、(3
‑
6C)
环烯基或杂芳基，其中每个
(1
‑
6C)
烷基
、(2
‑
6C)
烯基
、(2
‑
6C)
炔基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基
、(3
‑
6C)
环烯基和杂芳基任选被一个或多个
(
例如
1、2、3、4
或5个
)
取代基取代，所述取代基选自由
(1
‑
4C)
烷基
、
氧代
、
卤素
、
氰基
、
硝基
、
羟基
、
羧基
、NR
A4
R
A5
和
(1
‑
4C)
烷氧基组成的组，其中
R
A4
和
R
A5
各自独立地选自由氢和
(1
‑
4C)
烷基组成的组；并且每个
R2独立地为
‑
Y2‑
X2‑
Z2,
其中
Y2不存在或是式
‑
[CR
B1
R
B2
]
m
‑
的基团，其中
m
是选自
1、2、3
或4的整数，并且
R
B1
和
R
B2
各自独立地选自氢
、OH
或
(1
‑
2C)
烷基；
X2不存在或是
‑
O
‑
、
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)O
‑
、
‑
OC(O)
‑
、
‑
CH(OR
B3
)
‑
、
‑
N(R
B3
)
‑
、
‑
N(R
B3
)
‑
C(O)
‑
、
‑
N(R
B3
)
‑
C(O)O
‑
、
‑
C(O)
‑
N(R
B3
)
‑
、
‑
N(R
B3
)C(O)N(R
B3
)
‑
、
‑
N(R
B3
)C(NR
B3
)N(R
B3
)
‑
、
‑
SO
‑
、
‑
S
‑‑
SO2‑
、
‑
S(O)2N(R
B3
)
‑
、
或
‑
N(R
B3
)SO2‑
，其中每个
R
B3
独立地选自氢或甲基；并且
Z2选自氢
、(1
‑
6C)
烷基
、(2
‑
6C)
烯基
、(2
‑
6C)
炔基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基
、(3
‑
6C)
环烯基或杂芳基，其中每个
(1
‑
6C)
烷基
、(2
‑
6C)
烯基
、(2
‑
6C)
炔基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基
、(3
‑
6C)
环烯基或杂芳基任选地被一个或多个
(
例如，
1、2、3、4
或5个
)
取代基取代，所述取代基选自由
(1
‑
4C)
烷基
、
氧代
、
卤素
、
氰基
、
硝基
、
羟基
、
羧基
、NR
B4
R
B5
和
(1
‑
4C)
烷氧基组成的组，其中
R
B4
和
R
B5
各自独立地是氢或
(1
‑
2C)
烷基；条件是；当
n
＝1并且
T1和
T2彼此不同时，则
R1和
R2不都是
H
；当
n
＝1，
T1和
T2彼此不同并且
R1和
R2之一是
H
时，则
R1和
R2的另一个不是甲基；或当
n
＝2并且
R1和
R2每次出现都是
H
时，则
T1和
T2都是
‑
C(O)
‑
或都是
‑
NH
‑
。
48.
根据权利要求
47
所述的缀合物，其中
T2是
‑
C(O)
‑
。49.
根据权利要求
47
或
48
所述的缀合物，其中每个
R1独立地为
‑
Y1‑
X1‑
Z1,
其中：
Y1不存在或是
‑
(CR
A1
R
A2
)
m
‑
，其中
m
是
1、2、3
或4，并且
R
A1
和
R
A2
各自为氢或
(1
‑
2C)
烷基；
X1不存在或是
‑
O
‑
、
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)O
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)
‑
N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)C(O)N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)C(N R
A3
)N(R
A3
)
‑
或
‑
S
‑
，其中每个
R
A3
独立地是氢或甲基；并且
Z1是另外的寡核苷酸或者是氢
、(1
‑
6C)
烷基
、(2
‑
6C)
烯基
、(2
‑
6C)
炔基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基
、(3
‑
6C)
环烯基或杂芳基，其中每个
(1
‑
6C)
烷基
、(2
‑
6C)
烯基
、(2
‑
6C)
炔基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基
、(3
‑
6C)
环烯基和杂芳基任选地被一个或多个
(
例如
1、2、3、4
或5个
)
取代基取代，所述取代基选自由
(1
‑
4C)
烷基
、
氧代
、
卤素
、
氰基
、
硝基
、
羟基
、
羧基
、NR
A4
R
A5
和
(1
‑
4C)
烷氧基组成的组，其中
R
M
和
R
A5
各自独立地为氢或
(1
‑
2C)
烷基
。50.
根据权利要求
47
或
48
所述的缀合物，其中每个
R1独立地为
‑
Y1‑
X1‑
Z1，其中：
Y1不存在或是
‑
(CR
A1
R
A2
)
m
‑
，其中
m
是
1、2、3
或4，并且
R
A1
和
R
A2
各自独立地为氢或
(1
‑
2C)
烷基；
X1不存在或是
‑
O
‑
、
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)O
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)
‑
N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)C(O)N(R
A3
)
‑
、
‑
N(R
A3
)C(N R
A3
)N(R
A3
)
‑
或
‑
S
‑
，其中每个
R
A3
独立地是氢或甲基；并且
Z1是另外的寡核苷酸或是氢
、(1
‑
6C)
烷基
、
芳基
、(3
‑
6C)
环烷基或杂芳基，其中每个
(1
‑
6C)
烷基
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修，
申请(专利权)人：英国研究与创新组织，
类型：发明
国别省市：