本发明专利技术涉及一种重组４Ａβ１５在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，是将４Ａβ１５基因插入含有α－ｆａｃｔｏｒ信号肽的组成型酵母表达载体ｐＧＡＰＺαＡ中，经电击转化毕赤氏酵母菌株ＧＳ１１５，在ＹＰＤ平板上进行培养后获得工程菌株Ｇ１１５Ｚ２０００４Ａβ１５，经摇瓶发酵，在发酵上清中有高含量的４Ａβ１５的表达，发酵上清经ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于８５％的重组四价Ａβ１５。本发明专利技术利用以ＧＡＰ为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Ａβ１５的表达，并且通过在引物中引入ＸｈｏＩ和ＸｂａＩ酶切位点以及Ｋｅｘ２信号肽切割位点和终止密码子ＴＣＡ，保证了重组４Ａβ１５的天然氨端和羧端，大大提高工程菌株发酵上清中目标蛋白的含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组4Αβ 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法。通过构建毕赤氏酵母重组工程菌株，使酵母高效分泌表达重组四价 A β 15，经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85%的重组四价A β 15。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以进行性的记忆丧失、意识障碍 及人格变化为临床特征的中枢神经系统退行性疾病，也是最常见的一种老年痴呆。目前有 证据表明，β-淀粉样蛋白(i3-amyloid，Ai3)沉积是AD病理的中心环节。因此，以Αβ为 靶的免疫治疗方法成为AD研究的热点。已有的研究表明A β 42全肽疫苗临床试验在防治 AD方面切实有效，但出现一些副反应而被终止。通过去除可能引起副反应的A β 42C末端序 列，并将ΑβΝ末端B细胞表位串联形成多价Αβ疫苗，可达到有效且安全的免疫目的。四 价Αβ 15是4个Αβ42Ν端1_15氨基酸的串联体，目前国内生产的重组四价Aβ 15，主要是 大肠杆菌表达产物，其工艺缺陷是4Αβ 15基因在大肠杆菌表达系统中为胞内表达，表达 量低，且主要以包涵体形式存在。在生产的过程中，包涵体形式的蛋白质需要变性和复性， 纯化困难，增加成本。而且为了便于纯化，人们往往在4Αβ 15基因的下游带有一个组氨酸 标签序列，使得四价4Αβ 15在作为疫苗免疫人体的过程中可能产生一些非特异的抗体，从 而产生一些副作用。毕赤酵母(Picha pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不 高，适合于高密度发酵的大规模生产，尤其是以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体 系，表达外源蛋白时无需添加甲醇为碳源，可避免环境污染(甲醇是易挥发的有毒物质)和 减少下游产物纯化的步骤。此外Picha. patoris可将表达产物分泌于细胞外，而且自身蛋 白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化。目前国内外未见采用以GAP为启动子的毕赤氏 酵母表达体系表达重组四价A β 15的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组4Αβ 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方 法，是选用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价A β 15的表达，并且 通过在引物中引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和终止密码 子TCA，保证了酵母分泌表达的重组4Αβ 15的天然氨端和羧端。本专利技术所采用的技术原理是将4Αβ 15基因插入含有α -factor信号肽的组成型 酵母表达载体PGAPZ α A中，线性化后电击导入毕赤氏酵母菌株GSl 15 (购自Invitrogen公 司)，经摇瓶发酵获得工程菌株该工程菌株于2010年1月29日保藏于“中国典型培养物保 藏中心”，地址湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学，保藏登记号为CCTCCN0 :M2010034, 命名为6115Ζ20004Αβ 15，分类命名为毕赤氏酵母(Pichapastoris)，实现重组四价A β 15 在发酵上清中的分泌表达。收集发酵上清，用SDS-PAGE分析，发现有重组蛋白质的表达，其分子量为181((1，与四价4 0 15的理论值8KD不一致。Westernblot分析显示重组蛋白能够与Αβ 42抗体结合，具有免疫反应性。而且进一步采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间 质谱分析测定了重组蛋白的分子量和N端的氨基酸序列。质谱结果显示重组蛋白的分子量 为8KD，与理论值一致，N端的氨基酸序列亦与Αβ15Ν端的序列相同。重组蛋白被证实为 Αβ 15后，摇瓶发酵，发酵上清经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85% 的重组四价A β 15。本专利技术所采用的技术方案一种重组4Αβ 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，其步骤如下1、4Αβ15基因的克隆以含有4Αβ 15基因的质粒ρ415为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经回 收后与PMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取单菌落进行测序，确定阳性克 隆。引物序列如下Pl :5，-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3，P2 5' -GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3，2、构建重组表达质粒对含有4Αβ 15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样 用XhoI和XbaI酶切pGAPZ α A质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，构建成含有 α -factor信号肽的组成型酵母表达载体pGAPZaA_4A0 15。3、筛选重组工程菌株将组成型酵母表达载体pGAPZaA_4Ai3 15经AvrII酶切，然后采用电击方式将酶切 产物转化毕赤氏酵母GS115，将转化液涂布含有Zeocin 25，50，100 μ g/mL的YPD平板，培养 后获得抗性菌株，挑取ZeocinlOO μ g/mL抗性菌株进行PCR鉴定，选取阳性克隆即为工程菌 株，命名为 G115Z20004A3 15。4、摇瓶发酵将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28°C _30°C培养48_96h，使毕 赤氏酵母GSl 15分泌表达4Αβ 15。对上述重组4Α β 15进行检测(I)SDS-PAGE检测收集发酵上清，用12% SDS-PAGE检测发酵上清中重组4Α β 15 的表达。(2) Western blotting检测将丙酮沉淀后，将发酵上清加样进行12 %聚丙烯酰 凝胶电泳，然后用电转移至硝酸纤维膜上，用BSA封闭硝酸纤维膜，然后依次加入一抗 (Α β 42抗体)和二抗(羊抗小鼠HRP标记IgG)，TBST洗涤5次，HRP-DAB底物显色试剂盒 显色。(3)质谱分析从考染凝胶上切下重组蛋白带，送中山大学中山医学院蛋白质组 中心进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。5、重组四价A β 15的纯化。离心收集分泌型4Α β 15重组酵母工程菌株G115Z20004Ai3 15的发酵上清，然后用 IN NaoH 调节 pH 值至 7. 5-8. 5，载样于 UNOsphere 阴离子交换柱(1ml，Biorad. America), 先用 5-10ml 20mmolTris. cl (pH7. 5-8. 5)平衡 UNOsphere 阴离子交换柱，然后用 0-lmol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.3-0. 4mol/L NaCl目标洗脱峰，得到 纯度大于85%的重组四价Aβ 15。本专利技术利用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Αβ 15的 表达，并且通过在引物中引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和 终止密码子TCA，保证了酵母分泌表达的重组4A β 15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌 株发酵上清中目标蛋白的含量。附图说明 图1是本专利技术的重组表达质粒pGAPZaA_4A β 15的构建图。图2是本专利技术的酵母转化子的PCR的鉴定。1. DL-2000Marker ；2.宿主菌GS115 ； 3. GS115/pGAPZaA 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组４Ａβ１５在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，其特征在于，其步骤如下： １）、４Ａβ１５基因的克隆 以含有４Ａβ１５基因的质粒ｐ４１５为模板，设计引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物经回收后与ｐＭＤ１８Ｔ载体连接，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，挑取单菌落进行测序，确定阳性克隆；引物序列如下： Ｐ１：５’－ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ－３’ Ｐ２：５’－ＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＴＡ－３’ ２）、构建重组表达质粒 对含有４Ａβ１５基因的ｐＭＤ１８Ｔ载体进行ＸｈｏⅠ和ＸｂａⅠ的双酶切，回收小片段，同样用ＸｈｏⅠ和ＸｂａⅠ酶切ｐＧＡＰＺαＡ质粒，回收大片段，然后再用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，构建成含有α－ｆａｃｔｏｒ信号肽的组成型酵母表达载体ｐＧＡＰＺａＡ－４Ａβ１５； ３）、筛选重组工程菌株 将组成型酵母表达载体ｐＧＡＰＺａＡ－４Ａβ１５经ＡｖｒⅡ酶切，然后采用电击方式将酶切产物转化毕赤氏酵母ＧＳ１１５，将转化液涂布含有Ｚｅｏｃｉｎ２５，５０，１００μｇ／ｍＬ的ＹＰＤ平板，培养后获得抗性菌株，挑取Ｚｅｏｃｉｎ１００μｇ／ｍＬ抗性菌株进行ＰＣＲ鉴定，选取阳性克隆即为工程菌株，命名为Ｇ１１５Ｚ２０００４Ａβ１５； ４）、摇瓶发酵 将高表达的重组工程菌株接种于ＹＰＤ液体培养基中，２８℃－３０℃培养４８－９６ｈ，使毕赤氏酵母ＧＳ１１５分泌表达４Ａβ１５； ５）、重组四价Ａβ１５的纯化 离心收集分泌型４Ａβ１５重组酵母工程菌株Ｇ１１５Ｚ２０００４Ａβ１５的发酵上清，然后用１Ｎ ＮａｏＨ调节ｐＨ值至７．５－８．５，载样于ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ阴离子交换柱，先用５－１０ｍｌ ２０ｍｍｏｌＴｒｉｓ．ｃ平衡ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ阴离子交换柱，然后用０－１ｍｏｌ／Ｌ线性梯度的ＮａＣｌ洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集０．３－０．４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ目标洗脱峰，得到纯度大于８５％的重组四价Ａβ１５。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚志彬，谭琳，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。