一株高产制造技术

本发明专利技术公开了一株高产

【技术实现步骤摘要】
一株高产L
‑
苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物发酵工程
，特别涉及一株高产
L
‑
苹果酸的黑曲霉
(Aspergillus niger)
基因工程菌株及构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]L
‑
苹果酸，又名2‑
羟基丁二酸，分为左旋
L
‑
苹果酸
(L
‑
型
)、
右旋
L
‑
苹果酸
(D
‑
型
)
和外消旋
L
‑
苹果酸
(DL
‑
型
)
三种结构体
。
其中
L
‑
型与
DL
‑
型
L
‑
苹果酸相比具有易吸收优势，是未来几年的技术攻关重点
。
另外，
2020
年全球
L
‑
苹果酸总产量约为
15
万吨，其中
DL
‑
苹果酸产量较高，
L
‑
苹果酸产量仅有
4.2
万吨
。
随着全球居民对于健康食品需求增长，国际市场上对
L
‑
苹果酸的需求量以每年4％需求量逐年递增，
L
‑<br/>苹果酸在未来具有巨大的市场潜力
。
[0003]目前，
L
‑
苹果酸的合成方法有化学合成法
、
酶转化法和微生物发酵法
。
化学合成法和酶转化法合成
DL
‑
苹果酸或
L
‑
苹果酸所用原料分别来源于石油基化学品苯合成的顺丁烯二酸
(
马来酸
)
或反丁烯二酸
(
富马酸
)
，这对日趋严峻的能源问题提出了极大的挑战
。
微生物发酵法利用微生物能够高效利用可再生生物质多种碳源，极大程度的降低了生产成本，且微生物发酵法更为环保，是国家大力支持的领域
。
因此，开发高产
L
‑
苹果酸的微生物菌株势在必得
。
[0004]已报道的研究中，周洁等利用米曲霉在
30L
发酵罐中发酵生产
L
‑
苹果酸时，其
96h
的产酸量为
65g/L
，将发酵时间延长至
132h
，产酸量可达到
105g/L
；吴悦等利用寄生曲霉进行发酵生产
L
‑
苹果酸的时间延长至
192h
，其产量由
23g/L
提高至
55g/L。
但是周期较长的发酵并不适用于工业化生产，因此，缩短发酵周期并提高
L
‑
苹果酸的产量成为主要的研究方向
。
目前，也有研究表明在嗜热毁丝酶
、
黑曲霉中异源表达米曲霉来源的
L
‑
苹果酸转运蛋白
C4T318
，可以有效提高
L
‑
苹果酸的产量，但整体菌株的发酵周期依然维持在
150
小时以上，依旧不能满足工业化的生产
。
[0005]另外，刘浩等通过黑曲霉菌株过表达细胞膜上的
C4
‑
二元羧酸转运蛋白编码基因
(dct1)
强化
L
‑
苹果酸转运系统，使
L
‑
苹果酸的产量由
2.49g/L
提高至
5.94g/L
，较出发菌
S469
提高了
2.4
倍，但其副产物琥珀酸和富马酸的产量也有很大程度提高，说明
C4
‑
二元羧酸转运蛋白非
L
‑
苹果酸专一性的转运蛋白
。
因此，挖掘
L
‑
苹果酸专一性的转运蛋白至关重要，也是提高
L
‑
苹果酸合成量占总酸百分比有效途径
。
[0006]黑曲霉作为工业上成功生产柠檬酸的菌株，具有较强的有机酸代谢能力，是美国食品药品监督局认可的食品安全菌，其利用廉价的碳源发酵生产有机酸已有
100
多年的历史
。
将黑曲霉作为生产有机酸的优良底盘宿主菌，基因工程改良其细胞代谢生产
L
‑
苹果酸是最佳选择，其中对
L
‑
苹果酸转运蛋白的筛选是首要工作
。

技术实现思路

[0007]本专利技术为了解决上述技术问题，提供一株高产
L
‑
苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及构建方法和应用
。
×
106个
/ml
，在
35
‑
37℃
，
220
‑
250rpm/min
培养
24h
；
[0025]c.
向种子培养液中加入发酵培养基，种子培养液与发酵培养基的体积比为
1:(1.8
～
1:2)
，在
35
‑
37℃
，
180
‑
220rpm/min
的条件下进行发酵培养
72h。
[0026]进一步的，所述种子培养基包括葡萄糖
55
‑
60g/L
，
10
×
微量元素
100mL/L
；所述发酵培养基包括：葡萄糖
140
‑
180g/L
，
10
×
微量元素
100mL/L
，
CaCO38
％；
10
×
微量元素包括：
(NH4)2SO448
‑
49.5g/L、KH2PO44.5
‑
5g/L、MgSO4·
7H2O 0.4
‑
0.6g/L、CuSO4·
5H2O 0.006
‑
0.012g/L。
[0027]本申请具有以下有益效果
。
[0028]1、
本专利技术解决了现有黑曲霉发酵生产
L
‑
苹果酸过程中，会伴随副产物的生成，造成后续的
L
‑
苹果酸纯化工艺成本提高的问题，本专利技术的黑曲霉基因工程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一株高产
L
‑
苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉基因工程菌株是以经紫外诱变所得的高产
L
‑
苹果酸菌株为出发菌株，通过敲除草酰乙酸水解酶基因
oah
，并过表达黑曲霉来源的四碳二羧酸转运蛋白基因
dct3
构建得到；所述经紫外诱变所得的高产
L
‑
苹果酸菌株的保藏号为
CGMCC NO.40550。2.
一种权利要求1所述基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.
以经紫外诱变获得的高产
L
‑
苹果酸黑曲霉
CGMCC NO.40550
基因组为模板，通过
PCR
反应扩增基因
oah
左臂和右臂序列片段
、
潮霉素抗性基因
hyg
片段；将基因
oah
左臂序列
、
潮霉素抗性基因
hyg、oah
右臂序列克隆到载体
pCAMBIA1300
上，构建基因
oah
敲除质粒
pDO
；
S2.
以紫外诱变获得的高产
L
‑
苹果酸黑曲霉
CGMCC NO.40550
基因组为模板，通过
PCR
反应扩增获得基因
dct3
序列片段和启动子
PX3
序列片段；将基因
dct3
序列片段和启动子
PX3
序列片段克隆到载体
pDO
上，构建基因
dct3
过表达质粒
pDCT3
；
S3.oah
基因敲除且
dct3
基因过表达菌株的获得：将所述质粒
pDCT3
转化至经紫外诱变获得的高产
L
‑
苹果酸黑曲霉
CGMCC NO.40550
中，转化子经潮霉素抗性筛选获得
oah
基因敲除且
dct3
基因过表达的高产
L
‑
苹果酸的黑曲霉基因工程菌株
。3.
根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：基因
oah
左臂的上游和下游扩增引物如
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2
所示；基因
oah
右臂的上游和下游扩增引物如
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4
所示
。4.
根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：基因
dct3
的上游和下游扩增引物如
SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8
所示
。5.
根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：质粒
pDCT3
的转化方法为农杆菌介导法，在农杆菌介导转化黑曲霉之前，将质粒
pDCT3
首先电转化至农杆菌，电转条件为：电容：
22
‑
25uF
，电压：
2.3
‑
2.5kV
，电阻：
180
‑
200
Ω
，脉冲：
4.5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛鲜丽，王德培，刘书彤，戴文静，武胜，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：