反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法技术

本发明专利技术公开了一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，包括以下步骤：１）制备冷冻保护液，该冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成：１０％ＤＭＳＯ、４０％胎牛血清和５０％细胞悬液；２）将上述步骤１）所得的冷冻保护液逐步慢速降温，直至冷冻保护液被降温至－１９６℃；将上述－１９６℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。采用本发明专利技术的方法能延长反刍动物乳腺上皮细胞的保存时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织与细胞工程、转基因动物等研究领域，特别是对乳腺上皮细胞的 分离、纯化、培养和冻存的方法。
技术介绍
乳腺是重要的皮肤外分泌器官，具有多种生理、生化和免疫功能，能为婴儿或幼畜 提供充足的营养并满足其发育的需求。这些功能的充分发挥，有赖于乳腺本身经历的一系 列特异性变化乳腺发育、乳腺分化、泌乳及乳腺重建和复旧等。实际上，由于机体系统和局 部众多可变因素的相互作用，使得人们对于乳腺上皮细胞的发育、功能分化、复旧、免疫防 御等的研究存在很大的困难。动物细胞培养模型在一定程度上模拟体内环境而广泛应用于 生物学、医学、营养学、毒理学等领域，可用于研究细胞的形态、生长发育、细胞营养和代谢 以及病变等微观过程，进行外源性物质吸收机制、转运途径及作用机理等方面的研究。从复 杂的器官体外培养到简单的单一上皮细胞培养及细胞共培养模式，可以很好的解决对于特 定因素研究的问题。国内外先后有学者对反刍动物乳腺上皮细胞的体外培养做了研究，但 目前的研究主要停留在培养方法学、形态学及激素对乳腺细胞的调控等方面，且对于分离 方法，国内外报道不尽相同，分离效果不一，形态学资料不尽周全，涉及其免疫鉴定、微观结 构观察、冷冻保存的研究不多，对其泌乳功能的系统研究更少。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种分离纯化效果好的反刍动物乳腺上皮细胞 的分离纯化法，以及一种能延长保存时间的。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种反刍动物乳腺上皮细胞的分离、纯化培 养法，包括以下步骤1)、乳腺组织的取样选用已经与反刍动物相分离的乳腺，将去除结缔组织和脂肪后的乳腺分割成小块 组织，并经杀菌和清洗处理后；得体积为0. 9 1. 1mm3的乳腺组织块，备用；2)、制备培养液培养液按照下述投料比获得在每ml的DMEM/F12培养液中添加1 y g氢化可的松、5 y g转铁蛋白、5 y g胰岛素、 5 U g泌乳素、10ng表皮生长因子、2 y mol谷氨酰胺、100IU青链霉素和0. lml胎牛血清；3)、组织块培养将步骤1)所得的乳腺组织块放入铺过鼠尾胶原的细胞培养容器内，置37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，直至细胞覆盖80%的容器底表面积时，用质量浓度为0. 15%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的消化液于37°C消化悬浮上述贴壁细胞5-8min ；直至在倒置显微镜 下80-90%细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大后，立即用含10% (体积百分比)FBS的D-Hanks 液终止消化；所得的细胞悬液经过滤和离心，得细胞；用培养液清洗上述细胞3遍；最后用血细胞计数板调整细胞密度(采用培养液进 行稀释)，以5X 104/mL的密度植入培养板培养，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养； 培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得原代培养的乳腺上皮细胞；4)、乳腺上皮细胞的纯化将原代培养的乳腺上皮细胞采用差酶法和反复贴壁法，用以纯化上皮细胞；具体 如下差酶法先用质量浓度为0. 25%胰酶的消化液消化成纤维细胞lOmin，除去成纤 维细胞及消化液；再加入质量浓度为0. 15%胰酶和0. 02% EDTA的混合消化液消化上皮细 胞 3-5min ；反复贴壁法将得到的上皮细胞经过滤和离心、计数调整细胞密度(采用培养液 进行稀释)后，以5 X 104/mL的密度再种植于细胞培养瓶，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件 下培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复上述差酶法和反复贴壁法1 2次，得到预 纯化处理后的乳腺上皮细胞；当上述预纯化处理后的乳腺上皮细胞达到80%汇合时，去除培养液；用无Ca2+、 Mg2+的Hanks液冲洗细胞，然后加入质量浓度为0. 15%胰酶和0. 02% EDTA混合消化液，以 消化细胞，直至在倒置显微镜下80-90%细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大时，用10% FBS的 D-Hanks液终止消化；所得的即为纯化后的乳腺上皮细胞；5)、乳腺上皮细胞的传代培养将上述纯化后的乳腺上皮细胞经离心，得细胞，接着用培养液清洗细胞3遍；去 掉上清液，用培养液重新悬浮细胞，并用血细胞板计数调整细胞密度(采用培养液进行稀 释)，以5X 104/mL的密度植入培养瓶培养，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，隔日 换液。作为本专利技术的分离、纯化培养法的改进步骤3)中，铺过鼠尾胶原的细胞培养容 器内的乳腺组织块之间的距离为0. 45 0. 55cm ；细胞悬液用孔径为105 u m的不锈钢滤网过滤o本专利技术还同时提供了一种，包括以下步骤1)、制备冷冻保护液冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成10% DMS0、40%胎牛血清和50%细胞 悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM/F12基础培养基形成的混合物，细胞在细胞悬液中的 密度为lX106/mL，所述细胞为原代培养的乳腺上皮细胞、纯化后的乳腺上皮细胞或传代培 养的乳腺上皮细胞；2)、将上述步骤1)所得的冷冻保护液逐步慢速降温a、4°C降至_8°C，降温速率为1°C /min ；_8°C保持一分钟；b、_8°C 降至-20°C，降温速率为 0. 5°C /min ；c、-20°C 降至-120°C，降温速率为 0. 3°C /min ；4d、将上述步骤所得的-120°C的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被 降温至_196°C ；将上述_196°C的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。本专利技术旨在建立可用于反刍动物乳汁分泌机制、乳腺生理、乳期细胞凋亡、乳腺退 化以及乳腺与营养供应、疾病防治等相关研究的乳腺上皮细胞泌乳模型；专利技术涵盖了乳腺 上皮细胞分离、纯化、培养、生长、保存等过程。本专利技术反刍动物乳腺上皮细胞的分离纯化法，采用组织块培养法、经过差酶法 (0. 25%胰酶消化成纤维细胞，0. 15%胰酶及0. 02% EDTA消化上皮细胞)和反复贴壁法纯 化了上皮细胞，发现在添加了胰岛素、泌乳素、转铁蛋白等成分的DMEM/F-12培养液中，细 胞呈典型上皮样形态，传至第十代的细胞依旧增殖旺盛，生长迅速。为了证明本专利技术的优点，专利技术人作了如下的验证实验实验1、专利技术人对步骤4)所得的纯化后的乳腺上皮细胞和步骤5)所得的传代培养 的乳腺上皮细胞进行了如下鉴定，具体如下按照常规免疫细胞化学方法的实验步骤，一抗为兔抗鼠细胞角蛋白18抗体，二抗 为羊抗兔IgG，经DAB显色，观察乳腺细胞的上皮特性。结果如图3所示，发现CK_18特异性在乳腺上皮细胞中表达，并在传代后的上皮 细胞中检测到了相同的结果，说明培养的乳腺细胞角蛋白特性(上皮特性)依然存在。实验2、专利技术人对步骤4)所得的纯化后的乳腺上皮细胞和步骤5)所得的传代培养 的乳腺上皮细胞进行了超微结构观察，具体如下收集传代培养至第九代生长旺盛的乳腺细胞(1-5X106个)，1000r/min离心 lOmin，去除上清液，用冷2.5%戊二醛41固定过夜，经0. 1M磷酸缓冲液漂洗样品三次，再 用锇酸固定，后经乙醇梯度脱水、包埋、聚合、切片、染色等步骤制成超薄切片，在透射电 镜下观察乳腺细胞的超微结构。结果如图4所示。乳腺上皮细胞核内常染色体均勻分布， 胞质内有丰富的粗面内质网，成群排列，其上附有核糖体，此外还有丰富的游离核糖体、高 尔基复合体(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，其特征是包括以下步骤：１）、制备冷冻保护液：冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成：１０％ＤＭＳＯ、４０％胎牛血清和５０％细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与ＤＭＥＭ／Ｆ１２基础培养基形成的混合物，细胞在细胞悬液中的密度为１×１０６／ｍＬ，所述细胞为反刍动物原代培养的乳腺上皮细胞、纯化后的乳腺上皮细胞或传代培养的乳腺上皮细胞；所述反刍动物为牛；２）、将上述步骤１）所得的冷冻保护液逐步慢速降温：ａ、４℃降至－８℃，降温速率为１℃／ｍｉｎ；－８℃保持一分钟；ｂ、－８℃降至－２０℃，降温速率为０．５℃／ｍｉｎ；ｃ、－２０℃降至－１２０℃，降温速率为０．３℃／ｍｉｎ；ｄ、将上述步骤所得的－１２０℃的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被降温至－１９６℃；将上述－１９６℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红云，刘建新，赵珂，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]