一种红豆草根尖染色体制片方法技术

本发明专利技术提供一种红豆草根尖染色体制片方法，包括如下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种红豆草根尖染色体制片方法


[0001]本专利技术属于红豆草属植物根尖染色体制片领域，特别涉及一种红豆草根尖染色体制片方法
。

技术介绍

[0002]红豆草（
Onobrychis viciifolia
）是一种多年生草本植物，广泛分布于世界北部温带地区，具有抗旱
、
耐寒
、
耐瘠薄
、
适应性广
、
再生力强
、
草质优良
、
产量高
、
适口性好等特征，是蓄水保土，改良土壤，发展养殖业的优良牧草，被誉为“牧草皇后”。
红豆草具有一定的缩合单宁含量，通过防止放牧动物腹胀来减少温室气体排放，对畜牧业的发展有较高的价值
。
[0003]有研究统计，当前红豆草属约有
120
多种，不同品种在染色体数目和形态方面都有特征，经过前人的研究和记录发现，红豆草存在三种可能的倍性水平（
2x、4x 和 8x
）和两种基本染色体数（
x=7
和
x=8
），为探究红豆草的种植资源和品种多样性，需要对染色体数目进行快速鉴别，因此，亟待一种红豆草根尖染色体制片方法
。
[0004]当前多种植物已经有独特的根尖染色体制片方法，但通过延用他人的方法无法在红豆草染色体的制片中复制使用；而且，在压片过程中，没有一种现有方法能在不破坏盖玻片的情况下分离出清晰的染色体
。

技术实现思路

>[0005]本专利技术提供一种红豆草根尖染色体制片方法，利用根尖细胞染色体制片，对有丝分裂活跃时期的根尖分生区进行取材，通过固定
、
解离
、
染色和压片使染色体完全铺展开，对染色体数目统计，从而判断植株倍性，具体包括如下步骤：
S1、
材料培养：（1）挑选成熟未剥壳的红豆草种子，消毒，无菌水冲洗5‑6次后，将种子置于无菌发芽盒中；（2）将无菌发芽盒放于3‑
5℃
黑暗条件的培养箱中低温预处理
1.5
‑
2.5d
后，再转移到
23
‑
27℃
的光照培养箱放置3‑
5d
，等待种子萌发；（3）待种子根生长至1‑
2 cm
长时，剪取
0.4
‑
0.6 cm
长的根尖
。
[0006]S2、
预处理：将剪取的根尖放在预处理液中处理，获得有丝分裂中期染色体分裂相；
S3、
固定：倒掉预处理液，蒸馏水漂洗后，用卡诺固定液置于
4℃
冰箱固定
22
‑
26 h
后，经蒸馏水冲洗2‑4次后用
70%
酒精保存，置于低温冰箱备用；
S4、
解离：将根尖取出，用蒸馏水清洗2‑4次并吸干水分，放入
1mol/L HCl
中，
50
‑
70℃
环境下解离4‑
8 min
，再用蒸馏水清洗；解离可以将细胞壁之间的果胶层用酸水解，使细胞易于分散，细胞壁软化，便于压片
。
[0007]解离的时间需严格掌握，过短则细胞不易分离；过长又会使细胞变长，影响染色；随着
HCl
的解离时间增加，细胞壁会逐渐被解离，染色体也会被分解，进而不能在显微镜下找到清晰的中期染色体
。
[0008]S5、
染色：将根尖分生区切下，置于载玻片上，迅速在根尖上滴一滴改良苯酚品红染液，染色4‑
6min
后盖上盖玻片；
S6、
压片：按压吸取多余染液，在盖玻片覆盖根尖的部位，使用生物解剖针使解剖针尖端垂直，轻敲盖玻片1‑
2min
，使根端部组织分散摊开，呈一薄层，制备成玻片标本，以待镜检；
S7、
镜检：将制备的玻片标本置于目镜下观察，找出清晰散开的中期染色体
。
[0009]而且，所述步骤
S2
中预处理液为
0.002 mol/L 8
‑
羟基喹啉溶液，所述步骤
S2
中预处理的具体方法为：将剪取的根尖放入 0.002 mol/L 8
‑
羟基喹啉溶液中，3‑
5℃
低温环境下放置3‑
5 h
，获得有丝分裂中期染色体分裂相
。
[0010]而且，所述步骤
S3
中，卡诺固定液为乙醇和冰醋酸混合液，乙醇：冰醋酸 = 3
：1，两次蒸馏水清洗均为2‑4次
。
[0011]而且，所述步骤
S5
中，将所述根尖分生区切下
0.3
‑
0.5mm。
[0012]而且，所述步骤
S6
中，压片的具体方法为：在盖玻片上覆盖一滤纸，不移动盖玻片的同时垂直按压吸取多余染液；按压结束后取开覆盖的滤纸，按住盖玻片边缘，找到盖玻片覆盖根尖的部位后，使用生物解剖针，使解剖针尖端在下，垂直轻敲盖玻片1‑
2min
，使根端部组织分散摊开，呈一薄层，制备成玻片标本
。
[0013]而且，所述步骤
S7
中，镜检的具体方法为：将制作好的玻片标本置于目镜下观察，先在低倍镜下找到清晰的视野，再选用高倍镜详细观察计数并拍照记录，若发现重叠的分裂相，从显微镜上取下玻片标本后继续按照步骤
S6
中轻敲盖玻片观察，直至找出清晰散开的中期染色体
。
[0014]而且，所述步骤（1）中的消毒方法为：用
4%
‑
5%
次氯酸钠浸泡8‑
12min
对种子消毒，无菌水冲洗5‑6次后，将种子置于有湿润的双层滤纸的无菌发芽盒中；所述无菌发芽盒中铺设有湿润的双层滤纸
。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
1、
本专利技术解决提供一种红豆草根尖染色体制片方法，对有丝分裂活跃时期的根尖分生区进行取材，通过固定
、
解离
、
染色和压片使染色体完全铺展开，有利于染色体数目统计，从而判断植株倍性，解决传统红豆草染色体制片结果影响较大
、
制片成功率低
、
影响核型分析结果等问题，成本低廉
、
扩大取材范围
、
提升解离时间的效果；
2、
本专利技术提供的一种红豆草根尖染色体制片方法，解离的方法便捷且解离效果好，可以快速制备成清晰散开的中期染色体的红豆草根尖染色体玻片标本，节省玻片制作时间；
3、
采用本专利技术的技术方案，预处理和解离时间为
28
‑
30h
，玻片制作时间约5‑
10mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种红豆草根尖染色体制片方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、
材料培养：挑选成熟未剥壳的红豆草种子，使种子萌发，待种子根生长至1‑
2 cm
长时，剪取
0.4
‑
0.6 cm
长的根尖；
S2、
预处理：将剪取的根尖放在预处理液中处理，获得有丝分裂中期染色体分裂相；
S3、
固定：倒掉预处理液，蒸馏水漂洗后，用卡诺固定液置于
4℃
冰箱固定
22
‑
26 h
后，经蒸馏水冲洗2‑4次后用
70%
酒精保存，置于低温冰箱备用；
S4、
解离：将根尖取出，用蒸馏水清洗2‑4次并吸干水分，放入
1mol/L HCl
中，
50
‑
70℃
环境下解离4‑
8 min
，再用蒸馏水清洗；
S5、
染色：将根尖分生区切下，置于载玻片上，迅速在根尖上滴一滴改良苯酚品红染液，染色4‑
6min
后盖上盖玻片；
S6、
压片：按压吸取多余染液，在盖玻片覆盖根尖的部位，使用生物解剖针使解剖针尖端垂直，轻敲盖玻片1‑
2min
，使根端部组织分散摊开，呈一薄层，制备成玻片标本；
S7、
镜检：将制备的玻片标本置于目镜下观察，找出清晰散开的中期染色体
。2.
如权利要求1所述的一种红豆草根尖染色体制片方法，其特征在于，所述步骤
S1
中材料培养的具体方法为：（1）挑选成熟未剥壳的红豆草种子，消毒，无菌水冲洗5‑6次后，将种子置于无菌发芽盒中；（2）将无菌发芽盒放于3‑
5℃
黑暗条件的培养箱中低温预处理
1.5
‑
2.5d
后，再转移到
23
‑
27℃
的光照培养箱放置3‑
5d
，等待种子萌发；（3）待种子根生长至1‑
2 cm
长时，剪取
0.4
‑
0.6 cm
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佳妮，石凤翎，佟春艳，张雨桐，董佳琦，石如如，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：