一种制造技术

本发明专利技术公开了一种用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，包括以下步骤：在缓冲液中加入相同质量的聚合物单体

【技术实现步骤摘要】
一种DNA片段筛分介质及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于筛分介质及其制法与应用，具体为一种
DNA
片段筛分介质及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品在电场下移动速率不同而达到分离目的的液相分离技术，具有分离效率高，分析时间短，样品消耗少等优点
。
应用于分离生物大分子，如
DNA
领域时，根据毛细管内起“分子筛”作用的聚合物不同，把毛细管电泳分为毛细管凝胶电泳
(CGE)
和毛细管无胶筛分电泳
(NCGE)。
前者使用的凝胶物质主要是聚丙烯酰胺凝胶，制备困难，重复性差，寿命短等缺点限制了其发展；后者是在自由溶液中加入低粘度非交联的线性聚合物起到类似凝胶的筛分作用，以达到筛分的目的，尽管的它的分辨率略低于
CGE
，但是这种毛细管柱寿命长，操作简单，重复性好，在生物大分子的分离，尤其是在核酸分离方面有着广阔的应用前景
。
[0003]实现对生物大分子的分离，毛细管无胶筛分电泳所用的无胶筛分介质至关重要
。
理想的筛分介质需要有很强的亲水性，适度的粘度，还要具有动态涂覆的能力，以抑制电渗流以及消除
DNA
与毛细管管壁之间的吸附作用
。
单纯的均聚物能同时满足这三点要求较为困难，于是我们想到将两种各有优点的聚合物进行结合使用
。
两种聚合物结合的方式分为三种，一种是将两种线性聚合物直接进行混合，一种是将两种聚合物单体反应共聚，还有一种是将线性聚合物和聚合物单体反应聚合形成非交联的互穿聚合物
。
[0004]由于不同化学组成的聚合物的混合可能出现不溶的问题，如
Kim
等，
J Chromatogr A,1997,781:315
，曾尝试使用
PEO
和
HPC
的混合物，但分离效果很差
。
而将一种聚合单体在聚合物溶液中聚合形成非交联的互穿聚合物，可以克服不溶性问题，更好的结合两者的优点，已出现过较多的报道，如
Song
等，
Electrophoresis,2001,22:3688
‑
3698,
将丙烯酰胺单体溶于线性聚乙烯吡咯烷酮溶液，经过自由基聚合形成非交联互穿聚合物网络，这种体系的粘度小，具有动态涂层能力，分离效率高，最好的分离效果可以将
DNA
标准样品
pBR322/Haelll
中的
22
个片段很好的分开，而且
123bp/124bp
达到的单碱基分离
。
但是这种方法具有两个不可忽视的缺点，一是其中使用了有剧毒的溴化乙锭染料，二是采用的线性聚合物聚乙烯吡咯烷酮的分子量较大，后续形成长链聚合物对反应的冰浴条件较难控制且反应时间较长，得出未稀释的聚合物粘度较大难以取出，不利于实验的重现性和稳定性
。
[0005]总的来说，现有的筛分介质无法实现碱基数相同
、
分子量不同的
DNA
片段的分离，并且反应较难控制且反应时间较长，实验的重现性和稳定性不佳
。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种过程简单
、
反应容易控制
、
反应时间较短的用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，本专利技术的另一目的是提供一种重复性好
、
重现性强的
DNA
片段筛分介质，本专利技术的再一目的是
提供一种
DNA
片段筛分介质在碱基数相同
、
分子量不同的
DNA
片段分离中的应用
。
[0007]技术方案：本专利技术所述的一种用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，包括以下步骤：在缓冲液中加入相同质量的聚合物单体
、
线性聚合物，聚合物单体为
N
，
N
‑
二甲基丙烯酰胺单体，线性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮，涡旋混匀后搅拌除气，再加入引发剂和催化剂，在
35
～
40℃
水浴
、
无氧环境下进行自由基聚合，透析冻干
。
[0008]进一步地，缓冲液为三羟基甲基氨基甲烷
(Tris)
‑
硼酸
‑
乙二胺四乙酸
(EDTA)
缓冲液或三羟基甲基氨基甲烷
‑3‑
(N
‑
吗啡啉
)
乙磺酸
(Tris
‑
Mops)
缓冲液
。
三羟基甲基氨基甲烷
‑
硼酸
‑
乙二胺四乙酸缓冲液中的三羟基甲基氨基甲烷
、
硼酸
、
乙二胺四乙酸的摩尔比为
89
：
89
：2，
pH
为
8.2
～
8.4。
三羟基甲基氨基甲烷
‑3‑
(N
‑
吗啡啉
)
乙磺酸缓冲液的浓度为
25
～
30mmol/L
，
PH
为
7.8
～
8.0
，电流更加稳定
。
缓冲液优选为
Tris
‑
硼酸
‑
EDTA
缓冲液
。
[0009]进一步地，缓冲液中含染料
SYBR GREEN I
，加入量为0～
1.0
μ
g/ml。
[0010]进一步地，引发剂为过硫酸铵
(APS)
，浓度为8～
10mg/
μ
L
；催化剂为
N,N,N
’
,N
’‑
四甲基乙二胺
(TEMED)
，体积百分数为
10
～
12vol
％
。
[0011]进一步地，透析冻干是通过截留分子量为
12000
～
14000
的透析袋透析，中途每隔4～5个小时换水，去除未反应单体和低聚物；透析完成放到冻干机冻干
70
～
80
小时，得到白色带孔塑料状固体
。
透析时间为2天
。
冻干前先预冻2小时，保证管内聚合物呈固态
。
[0012]进一步地，筛分介质加入缓冲液中，涡旋混匀后，用
0.45
μ
m
的尼龙过滤器本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在缓冲液中加入相同质量的聚合物单体
、
线性聚合物，所述聚合物单体为
N
，
N
‑
二甲基丙烯酰胺单体，所述线性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮，涡旋混匀后搅拌除气，再加入引发剂和催化剂，在
35
～
40℃
水浴
、
无氧环境下进行自由基聚合，透析冻干
。2.
根据权利要求1所述的一种用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为三羟基甲基氨基甲烷
‑
硼酸
‑
乙二胺四乙酸缓冲液或三羟基甲基氨基甲烷
‑3‑
(N
‑
吗啡啉
)
乙磺酸缓冲液
。3.
根据权利要求2所述的一种用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，其特征在于：所述三羟基甲基氨基甲烷
‑
硼酸
‑
乙二胺四乙酸缓冲液中的三羟基甲基氨基甲烷
、
硼酸
、
乙二胺四乙酸的摩尔比为
89
：
89
：2，
pH
为
8.2
～
8.4。4.
根据权利要求2所述的一种用于毛细管无胶筛分电泳分离的筛分介质的制备方法，其特征在于：所述羟基甲基氨基甲烷
‑3‑
(N
‑
吗啡啉
)
乙磺酸缓冲液的浓度为
25
～
30mmol/L
，
PH
为
7.8
～
8.0。5.
根据权利要求1所述的一种用于毛...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丹科，何思，彭雨飞，孙艳艳，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：