一种离体组织稳定保护剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种离体组织稳定保护剂，包括以下步骤：１）配制ｐＨ为７．８～８．２的Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ；２）配制摩尔浓度为３．８～４．２ｍｏｌ／Ｌ的（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液；３）在６８０～７２０ｍｌ的（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液中加入Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ?１８０～２２０ｍｌ，然后于搅拌状态下滴加０．０８～０．１２Ｍ的ＮａＯＨ溶液，直至ｐＨ为８．１～８．２；再用１８．２Ｍ欧姆的去离子水定容至１０００ｍｌ；得离体组织稳定保护剂。本发明专利技术的离体组织稳定保护剂能在常温下保护离体组织的ＲＮＡ不被降解。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种保护液，可用于储存和保护新鲜样本，尤其指临床手术后的组织 样本。其可以保护组织样本中的RNA在常温下不被降解，从而可以用于随后的实验室研究 或临床试验。
技术介绍
关于人类疾病的研究具有特殊性，因为研究人类自身与其他动物不同的是，对于 其他动物，我们可以根据自己的需要，构建动物模型，比如小鼠，通过环境诱导使其得病，然 后再用药物治疗，在各个实验过程中可以设置正常小鼠参照，最后处死小鼠，取出组织，以 供我们做分子水平、细胞水平以及活体水平的各种科研实践。然而这对于人类就不可能通 过这种手段进行科研实践。虽然人类与小鼠的基因组有着90%以上的相似性，但还是存在 很大的差异，并且由于人的社会活动性，所处的环境不同，也造成了人与人之间的差异。因此，我们要研究人类自身的疾变，最多的是依赖于已患疾病的病人组织、血液、 体液等样本，通过基因芯片诊断、细胞生物学分析、组织切片、蛋白分离纯化等生物学技术， 并结合病人的个人信息，包括社会活动和环境接触，来推算出该疾病患病的原因。这就非常 依赖于现有疾病样本的收集和研究。而对于组织样本的研究，一般是根据组织中的RNA来 研究基因表达差异；或者通过组织中的DNA来研究基因组差异，比如测序研究单核苷酸多 态性，基因突变等；或者通过组织中的蛋白差异来研究一些特异性的标记物，从而筛选并发 现一些能用于早期诊断的分子标记物。然而，RNA—旦组织离体后，就很容易降解；质量差的组织，对于后续的科研工作 的重要性就会大大降低，甚至毫无作用，或者起误导作用。由于环境中充满了各种RNA酶， 从新鲜组织中提取RNA时，样品若不能马上处理，则通常需要立即保存于液氮，而液氮和超 低温冰箱并不能普及到每个实验室或者医院，并且液氮和超低温冰箱的维护也需要较高的 费用。液氮虽然解决了保存问题，但仍然无法有效的解决样品的运输问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供，本专利技术 的离体组织稳定保护剂能在常温下保护离体组织的RNA不被降解。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种离体组织稳定保护剂的制备方法，包括 以下步骤1)、配制 pH 为 7. 8 8. 2 的 Tris-EDTA ；2)、配制摩尔浓度为3. 8 4. 2mol/L的(NH4)2S04溶液；3)、在680 720ml步骤2)所得的(NH4) 2S04溶液中加入步骤1)所得的 Tris-EDTA 180 220ml，然后于搅拌状态下滴加0. 08 0. 12M的NaOH溶液，直至pH为 8. 1 8. 2 ；再用18. 2M欧姆的去离子水定容至IOOOml ；得离体组织稳定保护剂。作为本专利技术的离体组织稳定保护剂的制备方法的改进=TriS-EDTA和(NH4)2S04溶液中均以18. 2M欧姆的去离子水作为溶剂。本专利技术的离体组织稳定保护剂制备方法的最佳技术方案如下1)、配制 pH 为 8.0 的 Tris-EDTA;2)、配制摩尔浓度为4mol/L的(NH4) 2S04溶液；3)、在700ml步骤2)所得的(NH4) 2S04溶液中加入步骤1)所得的Tr i s_EDTA 200ml，然后于搅拌状态下滴加0. IM的NaOH溶液，直至pH为8. 15 ；再用18. 2M欧姆的去离 子水定容至IOOOml ；得离体组织稳定保护剂。上述pH为8. 0的Tris-EDTA的制备方法如下将0. 5 Imol 的 Tris 和 0. 002 0. Olmol 的 EDTA 溶解于 800ml 的 18. 2M 欧姆 的去离子水，利用0. IM的HCl溶液调节pH为8. 0 ；然后用18. 2M欧姆的去离子水定容至 IOOOml ；得 pH 为 8. 0 的 Tris-EDTA。在本专利技术中，NaOH溶液和HCl溶液均以18. 2M欧姆的去离子水作为溶剂。本专利技术还同时提供了利用上述方法制备而得的离体组织稳定保护剂。本专利技术的离体组织稳定保护剂是一种液态的、无毒的组织保存试剂，能迅速稳定 离体组织，保护非冷冻状态下的离体组织的RNA不被降解。使用本专利技术的离体组织稳定保 护剂，能实现在任何时间、任何地点收集临床组织样品；且不需要在液氮中冷冻样品或立即 将样品送回实验室冰箱保存，大大提高了样本收集的可操作性，是临床及科研领域内完美 的样本保护剂。由于浸泡在本专利技术的离体组织稳定保护剂的离体组织能常温下较长时间保 存，因此还可以解决样本(离体组织)在不同地方的运输问题。本专利技术的离体组织稳定保护剂可在常温下保存，保存期为1 2周；如在_20°C的 低温下则可长时间保存。在保存期内如果出现沉淀物，属正常现象，只需将其置于60度水 浴 锅蒸煮至澄清即可。本专利技术实际使用时，可将临床样本切割成小于0. 5cm的小块，然后将临床样本浸 泡在本专利技术的离体组织稳定保护剂中，一般每0. 5g的临床样本对应5. Oml的离体组织稳定 保护剂；从而使本专利技术的保护剂能渗入到样本的细胞中，从而稳定RNA。随后该浸泡在本发 明的稳定保护剂中的样品可于室温(25°C )保存1-2周，4°C保存3-6个月，或者在-20°C下 长期保存。在实际进行RNA分离时，只需将组织从稳定保护剂中取出，按照常规采集后进行 的常规操作即可。在-20°C下被冰冻的样品可用研钵研磨，或者使其解冻后按照处理新鲜组 织的方式进行常规操作，而不影响RNA的质量。综上所述，本专利技术的离体组织稳定保护剂能够成功维持RNA的完整性，大大提高了 RNA相关科学研究的工作效率。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是经本专利技术保护剂处理和未经处理的样本中提取的总RNA的电泳图；图2是经本专利技术保护剂处理和未经处理的样本中提取的总RNA的峰图；上述图1中，从第1-12条道的样本分别对应为1—0小时；2—无保护剂室温下1小时，3—无保护剂室温下4小时，4—无保护剂室温下24小时，5-无保护剂室温下1周；6—无保护剂4°C下3个月； 7—本专利技术的保护剂中室温下1小时，8—本专利技术的保护剂中室温下4小时，9一本 专利技术的保护剂中室温下24小时，10-本专利技术的保护剂中室温下1周，11-本专利技术的保护剂 中4°C下3个月，12—标记条带(ladder)。上述图2中， Ohr-O小时；Ihr-RT-无保护剂室温下1小时，4hr_RT—无保护剂室温下4小时， 24hr-RT—无保护剂室温下24小时，Iweek-RT-无保护剂室温下1周；3m0nth-4C—无保 护剂4°C下3个月；lhr-RT-sto—本专利技术的保护剂中室温下1小时，4hr-RT-sto—本专利技术的保护剂中 室温下4小时，24hr-RT-sto—本专利技术的保护剂中室温下24小时，7day-RT-St0—本专利技术的 保护剂中室温下1周，3m0nth—st0 4C—本专利技术的保护剂中4°C下3个月，ladder—标记 条带。具体实施例方式实施例1、一种离体组织稳定保护剂的制备方法，依次进行以下步骤1)、配制 pH 为 8.0 的 Tris-EDTA称取Imol的Tris和0. Olmol的EDTA，溶解于800ml的18. 2M欧姆的去离子水中， 用直径2cm的搅拌子在磁力搅拌器中300rpm搅拌，直至固体全部溶解，然后用移液枪缓慢 加入0. IM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离体组织稳定保护剂，其特征是包括以下步骤：１）、配制ｐＨ为７．８～８．２的Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ；２）、配制摩尔浓度为３．８～４．２ｍｏｌ／Ｌ的（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］溶液；３）、在６８０～７２０ｍｌ步骤２）所得的（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］溶液中加入步骤１）所得的Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ１８０～２２０ｍｌ，然后于搅拌状态下滴加０．０８～０．１２Ｍ的ＮａＯＨ溶液，直至ｐＨ为８．１～８．２；再用１８．２Ｍ欧姆的去离子水定容至１０００ｍｌ；得离体组织稳定保护剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王珺，洪旭涛，吴箭，姜超，陈莹莹，宓娅娜，
申请(专利权)人：杭州锐创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]