一种重组制造技术

本发明专利技术公开了一种重组

【技术实现步骤摘要】
一种重组III型人源化胶原蛋白氨基酸序列及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种重组
III
型人源化胶原蛋白氨基酸序列及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]胶原蛋白
(collagen)
是一种细胞外蛋白质，由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白占全身总蛋白质的
30
％以上
。
其对维护细胞
、
组织
、
器官的正常生理功能和损伤修复具有重要作用，因而，被视为是最有发展前途的天然生物医用材料之一
。
[0003]目前，胶原蛋白的主要来源是从动物皮组织中提取，然后利用酶解技术生产高纯度且有活性的动物来源胶原蛋白，这种胶原蛋白可称为第一代胶原蛋白制备技术，而随着生物技术的发展，利用
DNA
重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原蛋白，解决了传统提取法存在的病毒隐患，同时与天然胶原蛋白相比，人工设计的重组胶原蛋白的亲水性
、
稳定性和生物相容性显著提高
。
[0004]至今，胶原蛋白改性纺丝主要有两种方法：一种是使用化学交联剂改性，如用金属离子
、
甲醛
、
戊二醛
、
环氧化合物等作为交联剂
(CN 1213191C
；
CN 1481461A
；
[0005]CN 1100165C)
；另一种是与其它合成材料<br/>(CN 1206393C)
或天然高分子材料
(CN 1584150A)
的共混改性
。
使用高分子与胶原共混改性纺丝的报道中，如胶原蛋白与聚乙烯醇
(PVA)(CN 1492087A
；
CN1696362A)
共混制备复合纤维，其实是以聚乙烯醇为主导
、
而胶原只在其中充当添加剂的角色
。
[0006]四川大学林炜等人以动物胶原蛋白为主，利用聚乙二醇
(PEG)
与胶原蛋白的氢键作用，二者共混纺制胶原蛋白基
PEG
复合纤维
(CN101215733A)
，所纺制的纤维复合材料也可用于生物医用材料
。
[0007]现有技术中存在以下缺点：
1、
利用动物组织中提取的胶原蛋白纺丝，可纺性和力学性能都很差；
2、
分子量不均一的混合胶原蛋白制作的生物医用材料，具有在生物体内降解吸收过快缺陷；
3、
在使用交联剂方法进行胶原蛋白的改性时，交联剂本身的毒性和不稳定性以及交联反应不易控制等缺陷；
4、
甲醛
、
戊二醛等交联改性的胶原组织工程材料会抑制细胞生长，产生炎症反应甚至引起钙化
。
[0008]本专利技术是以基因工程技术生产分子量单一的重组
III
型人源化胶原蛋白为主，利用聚乙二醇
(PEG)
与胶原蛋白的共价修饰得到
PEG
化胶原蛋白基复合纤维纺丝原液，既克服了动物来源混合胶原蛋白可纺性差的问题也提高了医用材料的结构稳定性
、
组织相容性和低免疫反应，所纺制的复合医用纤维材料可作为手术缝合线
、
止血纱布等医疗用途
。
[0009]至目前为止，国内外还未见有
PEG
化重组
III
型人源化胶原蛋白复合纤维研究的文献报道或专利
。
GluArg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile ProGly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGlyPro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly ProAla Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro AlaGly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn GlyIle Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly AlaAlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaProGly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys GlyPro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly ProAsn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro ArgGly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg GlyAlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly GluLys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala AlaGly Pro AlaGly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly AlaPro Gly Pro Ala GlyPro Arg Gly Ala AlaGly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly GluArg Gly AlaPro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Ala
[0029]进一步的，
SEQ ID NO.2DNA
序列：
[0030]ggcccggcgggcccgaacggcattccgggcgaaa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组
III
型人源化胶原蛋白氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列包括
n
个重复的
SEQ ID NO.1
，
n
为大于等于1的整数，当
n
为大于等于2的整数时，各重复序列之间直接相连
。2.
根据权利要求1所述的重组
III
型人源化胶原蛋白氨基酸序列，其特征在于，
n
为
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22
或
24。3.
根据权利要求1所述的重组
III
型人源化胶原蛋白氨基酸序列，其特征在于，当
n
＝
18
时，得到的蛋白氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。4.
根据权利要求1所述的重组
III
型人源化胶原蛋白氨基酸序列，其特征在于，
SEQ ID NO.1
序列及其重复序列在大肠杆菌进行表达
。5.
根据权利要求3所述的重组
III
型人源化胶原蛋白氨基酸序列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101、
重组
III
型人源化胶原蛋白质粒构建：根据氨基酸序列
SEQ ID NO.2
和大肠杆菌密码子偏好性，设计并人工合成目标基因序列
hCOL3A1
，将所述目标基因通过
NdeI/XhoI
克隆到载体
pET
‑
30a(+)
上，经测序鉴定获得质粒载体
pET
‑
30a—hCOL3A1
；
S102、
重组
III
型人源化胶原蛋白基因工程菌筛选：将重组质粒
pET
‑
30a—hCOL3A1
转入大肠杆菌
BL21
中，
LB
平板筛选并通过摇瓶发酵确定表达情况；摇瓶发酵上清液经
SDS
‑
PAGE
电泳检测，在理论分子量
47kDa
位置有明显的电泳条带，确定获得重组人源
III
型胶原蛋白基因工程菌；
S103、
重组
III
型人源化胶原蛋白的发酵生产：
S1031、
种子培养：将步骤
S102
中得到的人源
III
型胶原蛋白基因工程菌转接于
500mL
液体培养基中摇床培养
6h
，得摇瓶种子液，
S1032、
一级种子罐扩大培养：将摇瓶种子液以1％的比例接种于灭过菌的种子罐中，通气搅拌培养
4h
，培养条件：转速
300rpm
，通气量
1.0vvm
，温度
37℃
，罐压
0.05MPa
；
S1033、
高密度发酵：将种子罐中种子液以1％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养，初始培养条件：转速
120rpm
，通气量
0.5vvm
，温度
37℃
，罐压
0.05MPa
，当溶氧低于
20
％后，逐步提高转速至
400rpm
，通气量至
2.0vvm
，控制
pH7.0
‑
7.1
，根据
pH
调整补料，发酵
OD600
至
30
以上时，加入诱导剂
1mM
异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷，降温至
28℃
并继续培养
10
‑
16h
；
S104、
重组
III
型人源化胶原蛋白纯化：用磷酸盐缓冲液
50ml
重悬
1L
发酵液收获的菌体沉淀，利用高压破菌仪器进行破菌后，
4℃
温度下
12000rpm
离心
60
分钟，使可溶性蛋白与固体杂质充分分离，收集离心后上清；最后用用
10KD
的超滤管，
4℃
低温下
4500rpm
离心
30
分钟，收集含有目的蛋白的浓缩液；用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换柱；然后将浓缩后的目的蛋白上柱，收集穿过的蛋白峰，即为纯化后的重组
III
型人源化胶原蛋白；所得胶原蛋白利用
SDS
‑
PAGE
检测纯度；
S105、PEG
共价修...

【专利技术属性】
技术研发人员：许驰名，缪克钎，朱海亮，
申请(专利权)人：南京巴凯星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：