一种用于快速制造技术

本申请公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的DNA聚合酶突变体及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程

。
具体而言，本专利技术涉及一种能够用于快速
PCR
和耐受复杂条件的
DNA
聚合酶突变体及其制备与应用
。

技术介绍

[0002]Taq DNA
聚合酶是一种属于
A
家族的具有耐热特性的
DNA
聚合酶，与
1976
年由
Chine
等人从水生嗜热菌
Thermus aquaticus
中分离而来
。1988
年
Saiki
等人将
Taq DNA
聚合酶应用到
PCR
中实现
PCR
反应的自动化
。
全长的
Taq DNA
聚合酶由
832
个氨基酸组成，最适反应温度在
75
～
80℃
，
95℃
处理半个小时能够保留一半的活力
。
在
70℃
，
Taq DNA
聚合酶能够以
60nt
速率延伸
DNA
链，在
55℃
时反应速率降为不到原来的一半
。Taq DNA
聚合酶是镁离子依赖聚合酶，最适镁离子浓度在2～
4mM
，而钠离子存在会抑制反应活性
。
[0003]随着
PCR
技术的推广，研究人员对
Taq DNA
聚合酶的要求也日益严苛，在一些特定场景中传统的
Taq DNA
聚合酶已然不能满足研究人员的需求，如减少
PCR
反应时间，提高对抑制剂的抵抗
。

技术实现思路

[0004]针对现有的一些技术问题，本专利技术提供一种能够用于快速
PCR
且具有抑制剂抵抗的
Taq DNA
聚合酶及其制备和应用
。
本专利技术的用于快速
PCR
且具有抑制剂抵抗的
Taq DNA
聚合酶延伸速度快，对常见的影响
Taq DNA
聚合酶活性的抑制剂抵抗性高，可用于减少时间的快速
PCR
以及在血清样本
、
氯化钠溶液样本中扩增目的基因
。
具体而言，本申请通过以下技术方案解决了本领域的技术问题
。
[0005]1.
一种
Taq DNA
聚合酶突变体，其与
SEQ ID No:3
所示的野生型
Taq DNA
聚合酶相比，包含选自
D655N、E681K、E742Q
和
M747R
组成的组的一个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合
。
[0006]2.
项目1所述的
Taq DNA
聚合酶突变体，其氨基酸序列如
SEQ IDNo:1
所示
。
[0007]3.
组合物，其包含项目1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体
。
[0008]4.
多核苷酸，其编码项目1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体，优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如
SEQ ID No:2
所示
。
[0009]5.
载体，其包含项目4所述的多核苷酸，优选地，所述载体为表达载体，更优选
pET
‑
22b。
[0010]6.
宿主细胞，其包含项目1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体
、
项目4所述的多核苷酸或项目5所述的载体，所述宿主细胞优选为原核细胞，更优选大肠杆菌感受态细胞
E.coil BL21。
[0011]7.
试剂盒，其包含项目1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体或项目3所述的组合物和使用说明书
。
[0012]8.
一种
PCR
扩增方法，其包括使用项目1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体或项目3所述的组合物或项目7所述试剂盒进行
PCR
扩增
。
[0013]9.
一种制备项目1‑2任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体的方法，其包括培养项目6所述的宿主细胞并诱导表达
Taq DNA
聚合酶突变体，并分离出所述
Taq DNA
聚合酶突变体
。
[0014]10.
项目9所述的方法，其中所述
Taq DNA
聚合酶突变体的分离包括收集宿主细胞，破碎细胞，离心，收集上清液并用于亲和纯化，优选镍柱亲和纯化后进行肝素亲和纯化
。
[0015]11.
通过项目9‑
10
任一项的方法制备的
Taq DNA
聚合酶突变体
。
[0016]本专利技术的有益技术效果：
[0017]本专利技术的上述
Taq DNA
聚合酶突变体与野生型
Taq DNA
聚合酶具有更加快速的延伸速度，可用于减少时间的快速
PCR
场景
。
[0018]本专利技术的
Taq DNA
聚合酶突变体具有更强的抵抗抑制剂的活性，可在含有氯化钠
、
血清样本中直接进行目的基因扩增
。
[0019]本专利技术提供的所述
Taq NDA
聚合酶突变体的制备方法，可以制备出不含有内源性核酸，活性高，热稳定性好，抗干扰能力强的
Taq DNA
聚合酶
。
附图说明
[0020]图1为实施例2中本专利技术的
Taq DNA
聚合酶突变体与野生型
Taq DNA
聚合酶在不同延伸时间下
PCR
效果
。
图
1A
扩增的序列为
SEQ ID No:4
，2‑5分别表示野生型
Taq DNA
聚合酶在延伸时间为
30s、20s、10s、5s
的
PCR
扩增结果；7‑
10
分别表示本专利技术
Taq DNA
聚合酶突变体在延伸时间为
30s、20s、10s、5s
的
PCR
扩增结果
。
图
1B
扩增序列为
SEQ ID No:5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Taq DNA
聚合酶突变体，其与
SEQ ID No:3
所示的野生型
Taq DNA
聚合酶相比，包含选自
D655N、E681K、E742Q
和
M747R
组成的组的一个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合
。2.
权利要求1所述的
Taq DNA
聚合酶突变体，其氨基酸序列如
SEQ ID No:1
所示
。3.
组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体
。4.
多核苷酸，其编码权利要求1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体，优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如
SEQ ID No:2
所示
。5.
载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸，优选地，所述载体为表达载体，更优选
pET
‑
22b。6.
宿主细胞，其包含权利要求1至2中任一项所述的
Taq DNA
聚合酶突变体
、
权利要求4所述的多核苷酸或权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚为民，温重政，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：