一种头孢菌素制造技术

本发明专利技术公开了一种人工合成的头孢菌素

【技术实现步骤摘要】
一种头孢菌素C酰化酶的人工合成及其突变体应用


[0001]本专利技术涉及了一种人工合成的头孢菌素
C
酰化酶及其突变体在合成头孢菌素母核中的应用，属于生物

。

技术介绍

[0002]7‑
氨基头孢烷酸
(7
‑
aminocephalosporanicacid,7
‑
ACA)
是头孢菌素
(
β
‑
内酰胺类
)
类药物的重要中间体之一
。
由于头孢菌素类抗生素具有抗菌谱广
、
疗效好
、
毒性低
、
同其他抗生素无交叉耐药性
、
且与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，近年来已经成为抗感染治疗中最重要的有效药物
。
头孢菌素
C(Cephalosporin C,CPC)
可经生物发酵
、
化学提炼制取，再经化学催化或酶催化水解获得7‑
ACA。
头孢羟氨
、
头孢拉定
、
头孢克罗等国外具有较高市场价值的抗生素目前均采用7‑
ACA
作为中间体合成
。7
‑
ACA
的化学合成法过程长
、
步骤多
、
反应条件苛刻
、
产生大量的三废，目前已较少应用
。
目前，酶法合成7‑
ACA
主要利用头孢菌素
C
酰化酶，但其合成技术仍有待改善，产量
、
质量上有待提高
。
随着头孢菌素
C
酰化酶在工业应用中价值的不断提高
,
如何提高酶活和产量成为研究者日益关注的问题
。
作为酶法生产7‑
ACA
过程的关键酶，对头孢菌素
C
酰化酶基因工程菌发酵方法的深入研究具有重要的理论意义和重大的社会价值
。
[0003]酶法催化
CPC
生产7‑
ACA
主要包括两步酶法和一步酶法
。
其中，两步酶法是通过
D
‑
氨基酸氧化酶
(D
‑
amino acid oxidase
，
DAAO)
将
CPC
转化为戊二酰基
‑7‑
氨基头孢烷酸
(glutaryl
‑7‑
aminocephalosporanicacid
，
GL
‑7‑
ACA)
；然后通过
GL
‑7‑
ACA
酰化酶将
GL
‑7‑
ACA
转化为7‑
ACA。
该过程中存在酶解路线长
、
氧化条件控制难度大
、
副产物多
、
产率低于化学裂解法等缺点
。
因此目前更多地采用一步酶法，即利用
CPC
酰化酶催化
CPC
酰胺键的水解反应
。
但是，目前自然界中发现的可水解
CPC
的头孢菌素
C
酰化酶菌株活力较低
。
因此，亟需挖掘或开发新的活力高
、
稳定性好的头孢菌素
C
酰化酶供产业化应用
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的首要目的是提供一种人工合成的头孢菌素
C
酰化酶及其突变体
。
所述头孢菌素
C
酰化酶的基因序列如
SEQ ID NO
：1所示
。
[0005]所述头孢菌素
C
酰化酶突变体是在所述
SEQ ID NO
：1所示序列上进行在第
L161、H296、H309、E320、A421
位进行突变得到的蛋白质
。
[0006]所述头孢菌素
C
酰化酶突变体进行的选自如下六种的任一种
、
任两种
、
任三种
、
任四种
、
任五种
、
或全部突变得到的蛋白质：
[0007](1)
将头孢菌素
C
酰化酶第
161
的亮氨酸突变为丙氨酸
、
谷氨酰胺
、
丝氨酸；
[0008](2)
将头孢菌素
C
酰化酶第
296
位的组氨酸突变为亮氨酸
、
丝氨酸
、
谷氨酸
、
苏氨酸；
[0009](3)
将头孢菌素
C
酰化酶第
309
位的组氨酸突变为丙氨酸
、
半胱氨酸；
[0010](4)
将头孢菌素
C
酰化酶第
320
位的谷氨酸突变为苏氨酸；
[0011](5)
将头孢菌素
C
酰化酶第
421
位的丙氨酸突变为缬氨酸
、
苯丙氨酸；
[0012]优选地，其为下述组合突变的突变体：
L161A/E320T、L161Q/A421F、L161S/A421V、H296T/A421V、H296S/A421F、H296E/H309A、H296L/H309C、E320T/A421F、L161A/E320T/A421F、L161Q/H296L/H309C/A421F。
[0013]本专利技术公开了一种所述头孢菌素
C
酰化酶及其突变体的编码基因与应用
。
[0014]本专利技术相应提供上述突变头孢菌素
C
酰化酶的编码核酸分子，其表达盒，含有所述编码基因或其表达盒的重组载体
、
含有所述基因或所述表达盒或所述重组载体的重组微生物
。
[0015]其中，所述核酸分子可以是
DNA
，如
cDNA、
基因组
DNA
或重组
DNA
；所述核酸分子也可以是
RNA
，如
mRNA
或
hnRNA
等
。
[0016]所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述突变头孢菌素
C
酰化酶的
DNA
，该
DNA
不但可包括启动突变头孢菌素
C
酰化酶编码基因转录的启动子，还可包括突变头孢菌素
C
酰化酶转录的终止子
。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种人工合成的头孢菌素
C
酰化酶，其特征在于，其氨基酸序列如
SEQIDNO.1
所示
。2.
一种头孢菌素
C
酰化酶突变体，其特征在于：选自下组至少一个氨基酸被另一个氨基酸替代：如
SEQIDNO:1
所示氨基酸序列中的
L161、H296、H309、E320、A421。3.
根据权利要求2所述的头孢菌素
C
酰化酶突变体，其特征在于：
L161
为丙氨酸
、
谷氨酰胺
、
丝氨酸所取代；
H296
为亮氨酸
、
丝氨酸
、
谷氨酸
、
苏氨酸所取代；
H309
为丙氨酸
、
半胱氨酸所取代；
E320
为苏氨酸所取代；
A421
为缬氨酸
、
苯丙氨酸所取代；优选地，其为下述组合突变的突变体：
L161A/E320T、L161Q/A421F、L161S/A421V、H296T/A421V、H296S/A421F、H296E/H309A、H296L/H309C、E320T/A421F、L161A/E320T/A421F、L161Q/H296L/H309C/A421F。4.
根据如权利要求1所述的头孢菌素
C
酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素
C
酰化酶突变体的下述（1）至（4）中任一种的生物材料：（1）编码权利要求1所述的头孢菌素
C
酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素
C
酰化酶突变体的核酸分子；（2）含有（1）所述核酸分子的表达盒；（3）含有（1）所述核酸分子的重组载体
、
或含有（2）所述表达盒载体；（4）含有（1）所述核酸分子的重组微生物
、
或含有（2）所述表达盒的重组微生物
、
或含有（3）所述重组载体的重组微生物
。5.
一种制备化合物
...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁波，孙周通，李湘莹，苏文成，曲戈，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：