一种用于干细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种用于干细胞

【技术实现步骤摘要】
一种用于干细胞3D培养用微载体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其是涉及一种用于干细胞
3D
培养用微载体，并进一步涉及该微载体的制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]细胞培养
(cell culture)
是指在体外模拟体内环境
(
无菌
、
适宜温度
、
酸碱度和一定营养条件等
)
，使之生存
、
生长
、
繁殖并维持主要结构和功能的一种方法
。
动物细胞系的大规模培养是生产病毒疫苗和其他生物技术产品的基础；人干细胞的培养可以用于扩大细胞数量，并将细胞分化为各种体细胞类型以进行移植；同时还可以用于收获干细胞释放的和外来体，以达到治疗发展的目的
。
[0003]三维细胞培养技术
(three
‑
dimensionalcell culture,TDCC)
是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养
,
使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移
、
生长
,
构成三维的细胞
‑
载体复合物；与传统的细胞培养不同，三维
(3D)
细胞培养重现了细胞的体内环境，三能够更好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，其自然条件可保持细胞间相互作用和更逼真的生化和生理反应；在
3D
环境中，细胞对内源性和外源性刺激
(
如温度
、pH、
营养吸收
、
转运和分化等方面的改变
)
应答更接近于它们在体内的反应
。
[0004]微载体是指在
60
‑
250
μ
m
，能适用于贴壁细胞生长的微珠；一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成；其以微小颗粒作为细胞贴附的载体，可提供相当大的贴附面积，由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使得细胞悬浮在培养液内，最终能够使细胞在载体表面繁殖成单层的一种
。
目前国际市场上出售的微型载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体
、
大孔明胶微载体
、
聚苯乙烯微载体
、PHEMA
微载体
、
甲壳质微载体
、
聚氨酯泡沫微载体
、
藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等
。
[0005]葡聚糖微球是微载体的一种，聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺是一种温敏材料，将聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺其枝接微载体表面即可通过改变温度实现细胞在微载体上的贴附和脱附，进而实现细胞的无损收获；但是葡聚糖微球在枝接聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺后，其对于细胞的吸附能力差，从而导致细胞贴附困难，会出现细胞大量悬浮的情况，进而导致最终培养的细胞形态发生改变，无法使用
。
[0006]因此，需要提供一种解决上述技术问题的技术方案
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的用于干细胞
3D
培养用微载体及其制备方法与应用，通过对葡聚糖进行改性制成微球后再枝接聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺，从而有效改善了现有技术中直接在葡聚糖微球表面枝接聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺导致细胞吸附能力差的问题，提高了细胞在微载体表面的贴附和增殖能力以及温敏脱附能力，同时提高了细胞的脱附收获速率
。
[0008]为达到本专利技术之目的，采用如下技术方案：
[0009]一种用于干细胞
3D
培养用微载体的制备方法，包括如下步骤：
[0010]步骤1：制备改性葡聚糖；
[0011]步骤2：制备葡聚糖微球；
[0012]以及，步骤3：在葡聚糖微球表面枝接聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺，得到微载体
。
[0013]优选的，所述步骤1中，改性葡聚糖的制备方法为：取葡聚糖溶解到
NaOH
溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在
37℃
下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入水芹根部提取液；
12h
后将反应混合液转入透析袋中，室温透析
3d
，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖
。
[0014]优选的，所述改性葡聚糖的制备方法中，
NaOH
溶液的浓度为
0.6mol/L。
[0015]优选的，所述改性葡聚糖的制备方法中，葡聚糖与1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液
、
水芹根部提取液的质量比为
1:30:0.5。
[0016]优选的，所述步骤2中，葡聚糖微球的制备方法如下：取改性葡聚糖溶解于去离子水中，而后加入聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入四甲基乙二胺和过硫酸钾，在
37
度条件下反应，
1h
后将所得的微球用重蒸水；洗3‑5遍，即得到葡聚糖微球
。
[0017]优选的，所述葡聚糖微球的制备方法中，各组分的用量为：改性葡聚糖
65
‑
75mg
；去离子水
1.5
‑
2.5mL
；聚乙二醇水溶液3‑
4mL
；四甲基乙二胺
90
‑
110
μ
L
；过硫酸钾
170
‑
180
μ
L。
[0018]优选的，所述步骤3中，在葡聚糖微球表面枝接聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺的步骤如下：
[0019]将聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球置于玻璃管中
,
通过依次抽真空和通入
N2,
重复3次
,
使其被
N2包围；而后将玻璃管在室温条件下超声处理；
24h
后
,
离心收集聚合物，并用甲醇纯化处理3‑5次后，再将微球在
50mmol/LEDTA
溶液中震荡
12h,,
最后用超纯水清洗后抽滤收集，即得微载体
。
[0020]优选的，所述聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球的质量比为1：
(80
‑
100)。
[0022]进一步的，本专利技术还提供一种微载体，该微载体采用如上述所述的方法制备得到；此外，本专利技术还提供了一种如上所述的微载体在干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于干细胞
3D
培养用微载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：制备改性葡聚糖；步骤2：制备葡聚糖微球；以及，步骤3：在葡聚糖微球表面枝接聚
N
‑
异丙基丙烯酰胺，得到微载体
。2.
根据权利要求1所述的一种用于干细胞
3D
培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，改性葡聚糖的制备方法为：取葡聚糖溶解到
NaOH
溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在
37℃
下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入水芹根部提取液；
12h
后将反应混合液转入透析袋中，室温透析
3d
，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖
。3.
根据权利要求2所述的一种用于干细胞
3D
培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述改性葡聚糖的制备方法中，
NaOH
溶液的浓度为
0.6mol/L。4.
根据权利要求3所述的一种用于干细胞
3D
培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述改性葡聚糖的制备方法中，葡聚糖与1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液
、
水芹根部提取液的质量比为
1:30:0.5。5.
根据权利要求4所述的一种用于干细胞
3D
培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，葡聚糖微球的制备方法如下：取改性葡聚糖溶解于去离子水中，而后加入聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入四甲基乙二胺和过硫酸钾，在
37
度条件下反应，
1h
后将所得的微球用重蒸水；洗3‑5遍，即得到葡聚糖微球
。6.
根据权利要求5所述的一种用于干细胞
3D
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥，梁信燊，马颖，
申请(专利权)人：广东龄值生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：