转座酶介导的对生物样品中的基因组制造技术

本公开涉及用于空间分析生物样品中用转座酶片段化的核酸的材料和方法

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转座酶介导的对生物样品中的基因组DNA在空间上加标签和分析的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求
2021
年1月
29
日提交的美国临时专利申请号
63/143,438
和
2021
年3月
26
日提交的美国临时专利申请号
63/166,708
的优先权
。
这些申请的内容全文以引用方式并入本文
。

技术介绍

[0003]由于不同细胞内不同的分析物水平
(
例如，基因和
/
或蛋白质表达
)
，故组织内的细胞在细胞形态和
/
或功能上具有差异
。
细胞在组织内的具体位置
(
例如，细胞相对于相邻细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置
)
可影响例如细胞的形态
、
分化
、
命运
、
活力
、
增殖
、
行为
、
信号传导以及与组织中的其他细胞的串扰
。
[0004]空间异质性先前已使用通常在完整组织或一部分组织
(
例如，组织切片
)
的背景下提供少量分析物的数据
、
或者提供来自各个单细胞的重要分析物数据的技术进行了研究，但未能提供关于来自起源生物样品
(
例如，组织
)
的单细胞的位置的信息
。
[0005]染色质结构在生物样品中的细胞之间或来自相同组织的生物样品之间可能存在差异
。
测定可及染色质中的差异可以指示特定细胞中的转录活性序列，例如基因
。
进一步了解染色质内的转录活性区将能够鉴定哪些基因对细胞的功能和
/
或表型有贡献
。

技术实现思路

[0006]本公开整体上描述了用于空间分析生物样品中存在的基因组
DNA
的方法
。
[0007]已经开发了研究表观基因组的方法，例如染色质可及性测定法
(ATAC
‑
Seq)
，或者鉴定与染色质相关联的蛋白质的测定法，例如
ChIP
‑
Seq。
这些测定法有助于鉴定促成动态细胞表型的调节因子
(
例如，顺式调节因子和
/
或反式调节因子
)。
虽然
ATAC
‑
Seq
和
ChIP
‑
Seq
在确定细胞群体内的表观遗传变异性方面具有不可估量的价值，但这些方法的常规应用在空间分辨促进细胞变异的相关联基因的能力方面有局限性
。
空间方法是已知的，然而，仍然需要附加方法和
/
或替代方法
。
[0008]因此，本公开整体涉及对核酸在空间上加标签和分析
。
在一些实施方案中，本文提供了利用转座子基因组来片段化基因组
DNA(
例如，开放染色质
、
可及染色质
)
并在空间阵列上捕获片段化
DNA
的方法，从而揭示了关于在生物样品的空间背景下有助于细胞调节的结构特征的表观基因组见解
。
[0009]本文提供了用于确定基因组
DNA
可及性的方法，该方法包括：
(a)
阵列上的生物样品，该阵列包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括：
(i)
空间条形码和
(ii)
捕获结构域；
(b)
使多个夹板寡核苷酸与生物样品接触，其中夹板寡核苷酸与捕获结构域杂交；
(c)
使转座子基因组与生物样品接触，以将转座子末端序列插入可及的基因组
DNA
中，从而生成片段化的基因组
DNA
；
(d)
将片段化的基因组
DNA
与夹板寡核苷酸杂交，并且将片段化的基因组
DNA
连接到捕获探针；
(e)
从连接的片段化基因组
DNA
中释放一个或多个
未连接的转座子末端序列；以及
(f)
确定
(i)
空间条形码的序列或其互补序列，和
(ii)
片段化基因组
DNA
的全部或部分序列，或者其互补序列，并且使用
(i)
和
(ii)
的确定序列来确定生物样品中的基因组
DNA
可及性
。
[0010]在一些实施方案中，阵列包括一个或多个特征
。
在一些实施方案中，一个或多个特征包括珠粒
。
[0011]在一些实施方案中，捕获探针还包括裂解结构域
、
一个或多个功能性结构域
、
独特分子标识符，或者它们的组合
。
[0012]在一些实施方案中，该方法包括主动迁移步骤，其中通过施加电场将片段化的基因组
DNA
迁移到阵列
。
[0013]在一些实施方案中，步骤
(b)
中的杂交包括将夹板寡核苷酸或其一部分与捕获探针的捕获结构域或其一部分杂交
。
在一些实施方案中，步骤
(d)
中的杂交包括将夹板寡核苷酸或其一部分与片段化基因组
DNA
的转座子末端序列或其一部分杂交
。
[0014]在一些实施方案中，使用
DNA
连接酶进行连接
。
[0015]在一些实施方案中，该方法包括使用片段化的基因组
DNA
作为模板来延伸捕获探针的3’
末端
。
在一些实施方案中，该延伸步骤使用具有链置换活性的
DNA
聚合酶进行
。
[0016]在一些实施方案中，该方法包括在夹板寡核苷酸与片段化的基因组
DNA
之间进行缺口填充
。
[0017]在一些实施方案中，转座子基因组包括转座酶，并且其中该转座酶是
Tn5
转座酶
、Mu
转座酶
、Tn7
转座酶
、
弧菌属
(Vibrio)
物种转座酶，或者它们的功能性衍生物
。
在一些实施方案中，
Tn5
转座酶包括与
SEQ ID NO
：1至少
80
％相同的序列
。
[0018]在一些实施方案中，步骤
(f)
中的确定包括对以下各项进行测序：
(i)
空间条形码或其互补本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于确定基因组
DNA
可及性的方法，所述方法包括：
(a)
阵列上的生物样品，所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针中的一个捕获探针包括：
(i)
空间条形码和
(ii)
捕获结构域；
(b)
使多个夹板寡核苷酸与所述生物样品接触，其中夹板寡核苷酸与所述捕获结构域杂交；
(c)
使转座子基因组与所述生物样品接触，以将转座子末端序列插入可及的基因组
DNA
中，从而生成片段化的基因组
DNA
；
(d)
将所述片段化的基因组
DNA
与所述夹板寡核苷酸杂交，并且将所述片段化的基因组
DNA
连接到所述捕获探针；
(e)
从所述连接的片段化基因组
DNA
中释放一个或多个未连接的转座子末端序列；以及
(f)
确定
(i)
所述空间条形码的序列或其互补序列，和
(ii)
所述片段化基因组
DNA
的全部或部分序列，或者其互补序列，并且使用
(i)
和
(ii)
的所述确定序列来确定所述生物样品中的基因组
DNA
可及性
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中所述阵列包括一个或多个特征
。3.
根据权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个特征包括珠粒
。4.
根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包括裂解结构域
、
一个或多个功能性结构域
、
独特分子标识符，或者它们的组合
。5.
根据权利要求1至4中任一项所述的方法，还包括主动迁移步骤，其中通过施加电场将所述片段化的基因组
DNA
迁移到所述阵列
。6.
根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤
(b)
中的所述杂交包括将所述夹板寡核苷酸或其一部分与所述捕获探针的所述捕获结构域或其一部分杂交
。7.
根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤
(d)
中的所述杂交包括将所述夹板寡核苷酸或其一部分与片段化基因组
DNA
的转座子末端序列或其一部分杂交
。8.
根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述连接使用
DNA
连接酶进行
。9.
根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括使用所述片段化的基因组
DNA
作为模板来延伸所述捕获探针的3’
末端
。10.
根据权利要求9所述的方法，其中所述延伸步骤使用具有链置换活性的
DNA
聚合酶进行
。11.
根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述连接步骤引起
DNA
分子的生成
。12.
根据权利要求1至
11
中任一项所述的方法，还包括在所述夹板寡核苷酸与所述片段化的基因组
DNA
之间进行缺口填充
。13.
根据权利要求1至
12
中任一项所述的方法，其中所述转座子基因组包括转座酶，并且其中所述转座酶是
Tn5
转座酶
、Mu
转座酶
、Tn7
转座酶
、
弧菌属物种转座酶，或者它们的功能衍生物
。14.
根据权利要求
13
所述的方法，其中所述
Tn5
转座酶包括与
SEQ ID NO
：1至少
80
％相同的序列
。15.
根据权利要求1至
14
中任一项所述的方法，其中步骤
(f)
中的所述确定包括对以下各项进行测序：
(i)
所述空间条形码或其互补序列，和
(ii)
所述片段化基因组
DNA
的全部或部分序列，或者其互补序列，然后进一步确定所述可及的基因组
DNA
在所述生物样品中的位
置
。16.
根据权利要求1至
15
中任一项所述的方法，还包括在所述生物样品与所述阵列接触之前或之后对所述生物样品成像
。17.
根据权利要求1至
16
中任一项所述的方法，其中步骤
(d)
中的所述释放包括对所述生物样品进行加热
。18.
根据权利要求
17
所述的方法，其中所述加热包括加热到约
65℃
至
85℃
的温度
。19.
根据权利要求
18
所述的方法，其中所述加热包括加热到约
65℃
至约
80℃
的温度
。20.
根据权利要求
19
所述的方法，其中所述加热包括加热到约
75℃
的温度
。21.
根据权利要求1至
20
中任一项所述的方法，还包括对所述生物样品进行染色
。22.
根据权利要求
21
所述的方法，其中所述染色包括苏木精和曙红染色
。23.
根据权利要求1至
22
中任一项所述的方法，其中使所述转座子基因组与所述生物样品接触是在化学透化条件下
、
在酶促透化条件下或这两种条件下进行的
。24.
根据权利要求
23
所述的方法，其中所述化学透化条件包括去污剂
。25.
根据权利要求
24
所述的方法，其中所述去污剂是
NP
‑
40、Tween
‑
20、Triton X
‑
100
和洋地黄皂苷中的一者或多者
。26.
根据权利要求
25
所述的方法，其中所述去污剂的浓度为约
0.001
％
(v/v)
至约
1.0
％
(v/v)。27.
根据权利要求1至
27
中任一项所述的方法，其中使所述转座子基因组与所述生物样品接触是在酶促预透化条件之后进行的
。28.
根据权利要求
28
所述的方法，其中所述酶促预透化条件包括蛋白酶
。29.
根据权利要求
29
所述的方法，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶
、
胶原酶
、
蛋白酶
K
，以及它们的组合
。30.
根据权利要求
30
所述的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶
。31.
一种用于确定基因组
DNA
可及性的方法，所述方法包括：
(a)
阵列上的生物样品，所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针中的一个捕获探针包括：
(i)
空间条形码和
(ii)
捕获结构域；
(b)
使转座子基因组与所述生物样品接触，以将转座子末端序列插入可及的基因组
DNA
中，从而生成片段化的基因组
DNA
；
(c)
将所述片段化基因组
DNA
的转座子末端序列与所述捕获探针的所述捕获结构域杂交；
(d)
释放未与所述捕获结构域结合的转座子末端序列；以及
(e)
确定
(i)
所述空间条形码的序列或其互补序列，和
(ii)
所述片段化基因组
DNA
的全部或部分序列，或者其互补序列，并且使用
(i)
和
(ii)
的确定序列来确定所述生物样品中的基因组
DNA
可及性
。32.
根据权利要求
31
所述的方法，其中所述阵列包括一个或多个特征
。33.
根据权利要求
32
所述的方法，其中所述一个或多个特征包括珠粒
。34.
根据权利要求
31
至
33
中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包括裂解结构域
、
一个或多个功能性结构域
、
独特分子标识符，或者它们的组合
。35.
根据权利要求
31
至
34
中任一项所述的方法，还包括主动迁移步骤，其中通过施加电
场将所述片段化的基因组
DNA
迁移到所述阵列
。36.
根据权利要求
31
至
35
中任一项所述的方法，其中步骤
(c)
中的所述杂交包括将所述转座子末端序列或其一部分与所述捕获探针的所述捕获结构域或其一部分杂交
。37.
根据权利要求
31
至
36
中任一项所述的方法，还包括使用所述片段化的基因组
DNA
作为模板来延伸所述捕获探针的3’
末端
。38.
根据权利要求
37
所述的方法，其中所述延伸步骤使用具有链置换活性的
DNA
聚合酶进行
。39.
根据权利要求
31
至
38
中任一项所述的方法，还包括在所述转座子末端序列与所述片段化的基因组
DNA
之间进行缺口填充
。40.
根据权利要求
31
至
39
中任一项所述的方法，其中所述转座子基因组包括转座酶，并且其中所述转座酶是
Tn5
转座酶
、Mu
转座酶
、Tn7
转座酶
、
弧菌属物种转座酶，或者它们的功能衍生物
。41.
根据权利要求
40
所述的方法，其中所述
Tn5
转座酶包括与
SEQ ID NO
：1至少
80
％相同的序列
。42.
根据权利要求
31
至
41
中任一项所述的方法，其中步骤
(e)
中的所述确定包括对以下各项进行测序：
(i)
所述空间条形码的所述序列或其互补序列，和
(ii)

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：一零x，
类型：发明
国别省市：