一种牛外周血制造技术

本发明专利技术涉及一种牛外周血

【技术实现步骤摘要】
一种牛外周血CD4
+
、CD8
+ T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)


[0001]本专利技术涉及动物医学领域，具体为一种牛外周血
CD4
+
、CD8
+ T
淋巴细胞流式检测试剂盒
(
间接荧光法
)。

技术介绍

[0002]CD3
分子是
T
细胞重要的表面标志，
CD3
+
淋巴细胞代表全
T
淋巴细胞
。CD4
+ T
淋巴细胞是
CD3
和
CD4
双阳细胞，同样
CD8
+ T
淋巴细胞是
CD3
和
CD8
双阳细胞
。
研究认为，淋巴细胞亚群的比例是奶牛免疫能力的重要指标，奶牛血液中
CD4
+
/CD8
+ T
淋巴细胞比值与牛奶体细胞分呈显著负相关，对奶牛乳房炎的诊断具有重要意义；
CD8
+
T
淋巴细胞比例与繁殖力显著相关，可作为提高奶牛繁殖性能的有用标记
。
[0003]目前检测
CD4
+ T、CD8
+ T
淋巴细胞主要有流式细胞术检测法和磁珠分选方法
。
[0004]流式细胞术是利用单克隆抗体对样本中存在的特定细胞类型进行定量分析，可以实现一个样本的多参数高通量筛选r/>。
牛外周血
CD4
或
CD8
细胞不会自然发出荧光，使用荧光染料标记的单克隆抗体与细胞表面特异性抗原结合，当细胞通过流式细胞仪的激光束时，将出现荧光信号，通过测定荧光信号强度计算细胞数量
。
应用流式细胞术对人
(
或小鼠
)
进行
T
淋巴细胞分析，均是在
CD3
荧光抗体鉴定到的细胞群中识别
CD4
+
、CD8
+ T
淋巴细胞亚群
。
而在牛上，仅使用
CD4
或
CD8
特异性单克隆荧光抗体通过流式细胞术检测出的阳性细胞，除了目标细胞外还包括其他细胞型别的非
T
淋巴细胞，比如
CD3
阴性的
CD3
‑
CD4
+
细胞或
CD3
‑
CD8
+
，准确性不高
。
[0005]磁珠分选
(MACS)
方法，将特定单克隆抗体的免疫球蛋白的两条特异性
F(ab)
段的一条标记磁珠，另一条与细胞表面抗原的抗原决定簇特异性结合
。
这样，标记单抗后的
CD4
+
、CD8
+ T
淋巴细胞经过
MACS
后，有磁性的细胞被吸附而得以分选
。MACS
每次只能根据一个参数分选，且纯度低于流式细胞仪方法，使用该方法对
CD3
+
CD4
+
、CD3
+
CD8
+
双阳性
T
细胞进行鉴定是不可行的
。
[0006]导致这些问题和缺点的原因：选择不同的荧光染料常用于识别不同的细胞亚群，同时检测
CD3
+
CD4
+
、CD3
+
CD8
+
双阳性的细胞，则要求
CD3、CD4
和
CD8
抗体的荧光标记不同，且对应流式细胞仪不同的接收通道
。
目前市场上可用的牛
CD4
和
CD8
荧光标记抗体有限，
CD3
标记抗体种类更少，有
BIO
‑
RAD
公司的
Mouse anti Bovine CD3(MCA6080)、Invitrogen
公司的
MA5
‑
28343
等，抗原号均是
MM1A
，且不带荧光标记，需要选择合适的荧光标记二抗进行流式分析
。
人和小鼠的
CD3
抗体较多，但是不同物种间
T
细胞表面抗原表达差异较大，交叉反应性低，荧光标记的抗人
(
或小鼠
)
的
CD3
抗体不能应用于牛
CD3
+ T
淋巴细胞的检测，如使用
BIO
‑
RAD
公司的
RAT ANTI HUMAN CD3(MCA1477)
对牛外周血进行检测，未检测到
CD3
+
阳性
。
此外，同时进行
CD3、CD4
和
CD8
多参数的综合分选，对抗体用量
、
孵育时间等预处理条件也提出了更高的要求
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种牛外周血
CD4
+
、CD8
+
T
淋巴细胞流式检测方法
。
一方面解决牛
CD3
阳性细胞流式细胞术检测的问题
。
根据一抗的物种来源和抗体亚型选择相应的荧光标记二抗，优化流式上机前预处理和检测条件，确保
CD3
阳性细胞的检出率
。
[0008]另一方面解决
CD3
+
CD4
+
和
CD3
+
CD8
+
双阳性细胞的检测，在圈定的
T
淋巴细胞群中，筛选
CD3、CD4
均为阳性或
CD3、CD8
均为阳性的细胞亚群，计算出双阳细胞的含量
。
[0009]本专利技术解决方案如下：一种牛外周血
CD4
+
、CD8
+
T
淋巴细胞流式检测试剂盒
(
间接荧光法
)
，包含有如下步骤：
[0010](1)
使用
EDTA
抗凝采血管分别采集所需检测牛的全血，设置样品管
、
空白对照管
、
单阳对照管，所述单阳对照管包括
CD3
单阳管
、CD4
单阳管和
CD8
单阳管，也称单染管和同型对照管，所述同型对照管包括
CD4
同型对照管和
CD8
同型对照管；
[0011](2)
在样品管和对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种牛外周血
CD4+、CD8+T
淋巴细胞流式检测试剂盒
(
间接荧光法
)
，其特征在于，包含有如下步骤：
(1)
使用
EDTA
抗凝管采集待检牛只全血，设置样品管
、
空白对照管
、
单阳对照管，所述单阳对照管包括
CD3
单阳管
、CD4
单阳管和
CD8
单阳管，也称单染管和同型对照管，所述同型对照管包括
CD4
同型对照管和
CD8
同型对照管；
(2)
在样品管和对照管加入相应抗体后混匀，
4℃
避光孵育或染色
30min
，孵育过程中再每
5min
混匀一次；
(3)
孵育完成后，加入红细胞裂解液裂解，然后再经过离心弃上清
、
弹散细胞
、
清洗细胞
、
重悬细胞，空白对照管
、
除
CD3
单阳管外的单阳对照管和同型对照管等待上机检测；
(4)
在样品管和
CD3
单阳管加入
30
μ
l 1:100
荧光二抗，
4℃
避光孵育
30min
，所述荧光二抗是
10
μ
l Goat anti Mouse IgG1:FITC
，
STAR132F
；溶于
990
μ
lstaining buffer
配制而成；
(5)
孵育完成再次经过离心弃上清
、
弹散细胞
、
清洗细胞
、
重悬细胞，
CD3
单阳管等待上机检测；
(6)
在样品管加5μ
l Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647
和5μ
l Mouse anti Bovine CD8:RPE
，
4℃
避光孵育
30min
后上机检测
。2.
根据权利要求1所述的牛外周血
CD4+、CD8+T
淋巴细胞流式检测试剂盒
(
间接荧光法
)
，其特征在于，样品管中第二步加入的抗体是
Mouse anti Bovine CD3
，加入量为
2.5
μ
l。3.
根据权利要求1所述的牛外周血
CD4+、CD8+T
淋巴细胞流式检测试剂盒
(
间接荧光法
)
，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵秀新，李建斌，王雅春，徐千雯，赵贵民，刘燕，李彦芹，薛光辉，高运东，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所宁夏大学，
类型：发明
国别省市：