一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法。所述体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，由高转移人肝癌细胞ＭＨＣＣ９７Ｈ和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。所述构建方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：将ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液、胎牛血清和青链霉素溶液以体积比为１００∶１０∶１的比例混合得到混合培养液；第二步：将１×１０７高转移人肝癌细胞ＭＨＣＣ９７Ｈ混悬在混合培养液中，随后置入ＲＷＶ生物反应器中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块，三维旋转混合培养。本发明专利技术可较好地模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理阶段组织标本以用于侵袭转移“过程”关键蛋白分子的筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了，属于肿瘤侵袭转 移体外实验模型及其构建方法

技术介绍
在全球恶性肿瘤死亡率排序中，肝癌是位居第三位的疾病，在我国则位居第二位， 过去二十年，肝癌临床、基础研究均取得长足进步，但肝癌的总体预后并无显著改善，其总 体术后5年复发率依然高达61.5%，即使是小肝癌术后5年复发率也高达43. 5%，转移和 复发成为进一步提高肝癌治疗效果与预后的最大障碍，而肝癌转移复发的发生与癌细胞的 生物学行为(黏附、运动、增殖、侵袭)、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成及靶器官性 质等许多因素有关，传统的转移性人肝癌细胞系、动物模型以及单因素、单基因相关性分析 模式已经无法满足肝癌侵袭转移分子病理机制的实验解析，且目前报道的大量转移相关基 因、蛋白多来源于转移瘤和原发瘤的比较、癌与癌旁组织的比较、以及转移潜能不同细胞系 之间的比较等，这些“果”之间的比较，忽略了转移的起步阶段及靶器官特异选择后期阶段 的“过程”关键调控蛋白的筛查，因此探索和建立新型体外侵袭转移模型或转移研究体系成 为肝癌转移新理论、新机制发现的保证。理想的体外转移模型既能较好地模拟肿瘤的生存转移环境，也应有助于肿瘤细胞 的恶性生物学行为的实验解析。在肝癌体外转移模型建立方面，复旦大学肝癌研究所进行 了大量创造性的工作，先后建立了人肝癌裸小鼠移植模型(LTW1-LTNM4)、人肝癌裸大鼠移 植模型(LTNR1、LTNR2)，高转移人肝癌裸小鼠模型(LCI-D20)、转移潜能不同人肝癌细胞系 (MHCC97L，MHCC97H，LM3，LM6)，上述转移模型被国内外学者大量研究应用，对肝癌转移复发 分子机制的阐明起到积极的推动。但从肿瘤细胞生物特性来看，体外多次传代的二维贴壁 培养易改变或丢失肿瘤细胞的某些表型特征、生物特性，我们的前期工作也显示三维状态 下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌 细胞系，高转移人肝癌细胞MHCC97H置于RWV生物反应器与生物支架PLGA相结合的三维旋 转培养体系中培养可形成转移性肝癌类组织体，其在组织形态结构、特征基因表达、蛋白分 泌情况、动物成瘤及转移能力等方面具有更接近体内转移性肝癌实体瘤生长病理特征(专 利申请号CN200910048099. 1,专利公开号CN101508973)，优于目前常用的转移性人肝癌细 胞模型，新型三维肝癌类组织模型建立无疑对肝癌转移研究观念更新带来可能。三维微重 力体外旋转培养获得类组织模型与实体瘤生长特性更为接近，可再现肿瘤细胞自然状态和 生存环境，而在三维状态下，将高转移MHCC97H细胞与靶器官肝组织块旋转混合培养，能理 想地模拟出癌细胞从黏附、浸润、到镜下癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理 阶段组织标本以用于转移前期及后期关键蛋白分子的筛查，也更易在体外通过抑制剂或促 进剂控制黏附、侵袭、转移的条件而不受动物个体差异带来的干扰，同时在临床抗转移药物 的筛选与评估中也有更直接的意义。临床大量实践表明，肝内播散与肺转移是肝癌转移最常见的两种形式，为构建宜于直接检测、观察肝癌肝侵袭转移过程的体外研究模型，本专利技术应用组织工程领域RWV生 物反应器系统，利用其低剪切、微重力体外三维培养环境，将高转移潜能人肝癌细胞系与裸 鼠肝组织块共同旋转培养，模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成全过程，构建肝癌 肝侵袭转移体外研究模型，用于肝癌肝侵袭转移过程病理改变分析及“过程”关键蛋白筛 查，此类体外实验模型目前国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，该模型可较好模拟癌细 胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的病理全过程，解决三维状态下缺少理想肝癌侵袭转移实 验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题，有助于深入 解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案提供一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型， 其特征在于，由高转移人肝癌细胞MHCC97H和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。本专利技术还提供了上述体外肝癌肝侵袭转移实验模型的构建方法，其特征在于，具 体步骤为第一步将DMEM/F12培养液、胎牛血清和青链霉素溶液以体积比为100 10 1 的比例混合得到混合培养液；第二步将1 X IO7高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在IOml第一步获得的混合培养 液中，随后置入IOml的RWV生物反应器中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块，先 静止IOmin再以速度7rpm/min 8rpm/min旋转培养10 15min，重复三次，然后静止30 分钟，后以速度7rpm/min 8rpm/min旋转培养过夜，次日根据细胞团块的大小调节旋转培 养速度，以悬浮在一个水平位置且不触及RWV反应器壁为宜，每36小时更换一次培养液，培 养第7天后，旋转培养速度达到ISrpm/min，每24小时更换一次培养液，到第15天，三维旋 转混合培养结束。所述的青链霉素溶液是将青霉素和链霉素溶于0. 85g/100ml氯化钠溶液中得到， 所述的青霉素的浓度是10000单位/ml，所述的链霉素的浓度是10000单位/ml。所述裸鼠肝组织块的长、宽和高分别为2 3mm、2 3mm和2 3mm。所述的混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块由以下方法得到采用颈椎脱白方法处 死裸鼠后，手术获取裸鼠肝脏，用生理盐水冲洗直至无血液，将裸鼠肝脏组织切割为所需尺 寸大小，浸泡在第一步获得混合培养液中进行预平衡。本专利技术的原理如下体外多次传代的二维贴壁培养易改变或丢失肿瘤细胞的某些 表型特征、生物特性，也经常出现基因水平表达模式、药物筛查情况与临床标本不一致的情 况。三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、侵袭、成瘤转移等方面明显不 同于两维的人肝癌细胞系，细胞的生物学特征与体内癌细胞真实的生理病理状况也更为接 近。受技术和方法的限制，在体外肝癌侵袭转移实验模型建立方面，依然缺乏理想模型，RWV 生物反应器旋转培养体系的专利技术在三维培养方法学进展中具有突破性的意义，该装置由一 水平旋转并能通过底部硅树脂膜进行气体交换的壁式组织培养器皿和旋转控制器组成，通 过对旋转速度的调节形成低剪切、微重力体外环境，增强培养细胞的组织样黏附与聚集，并 对细胞的生长增殖，分化，细胞因子分泌及细胞间的相互作用产生影响，优于静止及其它高剪切的旋转三维培养技术，是三维细胞培养领域、组织再生领域有潜在临床应用前景的技术之一。本专利技术创造性地应用RWV生物反应器三维旋转培养体系，将高转移人肝癌细胞系 MHCC97H与靶器官肝组织块旋转混合培养，通过对旋转速度的调节和不同时间的病理分析， 模拟癌细胞从黏附、浸润、到镜下癌巢形成的全过程，且在整个病理改变过程中，肝癌肝侵 袭转移关联基因表达水平变化呈现不同特点，提示该模型可用于体外肝癌肝侵袭转移实验 研究。本专利技术的优点如下该新型肝癌肝侵袭转移体外模型较好地模拟出肝癌细胞从黏 附、侵袭到肝内癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理阶段组织标本以用于侵 袭转移“过程”关键蛋白分子的筛查，也更易在体外通过抑制剂或促进剂控制黏附、侵袭、转 移的条件而不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，由高转移人肝癌细胞ＭＨＣＣ９７Ｈ和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔杰峰，刘银坤，唐建华，陈荣新，戴继灿，郭坤，陈军，陈洁，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]