一种基于制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于DC Line诱导的CTL细胞及其制备方法
[0001]本申请要求于
2023
年
01
月
18
日提交中国专利局
、
申请号为
2023100791810、
专利技术名称为“CTL
细胞的制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中
。


[0002]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种基于
DC Line
诱导的
CTL
细胞及其制备方法
。

技术介绍

[0003]黑色素瘤是由位于表皮基底层的黑色素细胞恶性转化而引起的最具侵略性的癌症之一
。
黑色素瘤仅占所有皮肤癌的5％，但由于其高度转移潜力，导致约
80
％的皮肤癌引起的死亡
。
由于缺乏有效的治疗手段，转移性黑色素瘤患者的
10
年总生存率为
10
％至
15
％
。
近些年，免疫治疗异军突起，有望给黑色素瘤患者带来新的
、
有效的治疗手段
。
[0004]美国食品药品监督管理局批准的用于治疗黑素瘤的免疫相关方法包括：
(1)T
细胞刺激细胞因子，如白介素
2(IL
‑
2)
；
(2)
检查点分子，如细胞毒性
T
细胞淋巴细胞相关蛋白
4(CTLA
‑
4)
和程序性细胞死亡蛋白
1(PD
‑
1)
阻断抗体，它们中和
T
细胞的抑制信号；
(3)
溶瘤病毒，引起粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子分泌和树突状细胞激活，从而增加肿瘤抗原的加工和向
T
细胞的呈递
。
这些免疫疗法的共同特征是激活
T
细胞或者促进
T
细胞的激活
。
因此，近年来开发出另一种方法，即活化
T
细胞的过继细胞疗法
(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT)。
[0005]ACT
需要在体外分离
、
鉴定
(
或产生
)
抗肿瘤淋巴细胞，然后体外扩增到一定数量后重新注入
(“转移”)
到患者体内
。
与主动免疫和非特异性免疫刺激相比，
ACT
具有理论和实践优势，包括能够识别能够体外杀伤的确切
T
细胞群，并选择它们进行扩增
。
这些细胞可以在体外被激活，脱离可能阻止它们完全发挥其抗肿瘤潜力的潜在抑制性肿瘤微环境
。
在抗肿瘤细胞转移之前立即对淋巴衰竭的宿主患者进行一定处理，可以消除潜在的抑制影响
(
如调节性
T
细胞
)
，为细胞在体内增殖和被激活提供最佳环境
。
[0006]ACT
开发的一个热点方向，是
DC
‑
CTL
技术
。
目前，利用
DC、T
细胞技术治疗肿瘤已成为一种疗效最佳的肿瘤生物疗法之一，但是仍存在一定的局限性
。
采用常规方法培育
DC
细胞，一方面需要使用的初始细胞量大
、
培育过程复杂，导致
DC
细胞获取困难
、
成本高；另一方面获得的
DC
细胞不均一，其成熟度差异较大且整体不高，导致抗原递呈能力较弱，致敏性差，并且没有合适的佐剂来提高
DC
对抗原的呈递作用，从而出现免疫作用低
、
免疫耐受等而导致肿瘤患者治疗效果不佳
、
术后存在复发及转移等问题
。
这些问题限制着
DC
‑
CTL
技术的临床应用
。
[0007]病毒感染
(viral infection)
是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程
。
人类病毒是指能感染人体或对人有致病作用的病毒
。
机体感染病毒后，可表现出不同的临床类型
。
依据有无症状，可分为显性感染和隐性感染；依据病毒滞留时间
及症状持续时间长短，又可分为急性感染和持续性感染
。
[0008]流行性感冒，简称流感，是由甲
、
乙
、
丙三型流感病毒分别引起的一种急性呼吸道疾病，属于丙类传染病
。
流感在中国以冬春季多见，临床表现以高热
、
乏力
、
头痛
、
咳嗽
、
全身肌肉酸痛等全身中毒症状为主，而呼吸道症状较轻
。
流感病毒容易发生变异，传染性强，人群普遍易感，发病率高，历史上在全世界引起多次暴发性流行，是全球关注的重要公共卫生问题
。
[0009]虽然针对流感病毒感染引起的大流行病，我们已经开发出了疫苗进行保护，且取得了很好的效果，通过疫苗得到了有效控制
。
但是疫苗防护也有其局限性，对于健康人，疫苗效果好，但是对于已经被病毒感染的人群，疫苗并没有好的效果；尤其是病毒一旦潜伏下来，将基因整合进宿主基因组内部，此时基本没有有效的治疗手段
。
再有，流感病毒变异速度快，往往旧毒株的疫苗对新毒株并没有防护能力
。
[0010]针对被病毒感染的细胞以及肿瘤细胞，我们人体内的免疫细胞是能够识别并清除这些细胞的
。
而且对于表面抗原变异的毒株侵染，免疫细胞能够在清除被感染细胞的同时，暴露这些变异抗原，从而一并将病毒清除
。
但是体内这种能清除特异性细胞的比例极低，导致病症反反复复发作
。
[0011]近些年新兴起来的细胞治疗手段，就是利用我们自身的免疫细胞，在体外进行教化或者改造扩增，使其具有杀伤特定病毒感染细胞
、
肿瘤细胞的能力后，回输到体内后，杀伤病变细胞
。
细胞疗法用于抗病毒治疗有以下优点：
1)
可清除潜伏期感染
‑
尤其像艾滋
、
乙肝等潜伏期长的病毒感染；
2)
对表面抗原变异快速的病毒同样有效
‑
如流感
、
新冠等
。
[0012]细胞治疗，属于免疫治疗的一种，使用患者自体的细胞
(
特殊情况下可以使用异体细胞
)
，在体外定向培养
、
改造后回输，用于治疗
、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
采用
DC
细胞株负载抗原活化
、
扩增
T
细胞，获得特异性杀伤细胞
CTL
的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
抽取受试者外周血，采用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞
PBMC
；
(2)
复苏
DC
细胞株，培养至对数生长期，调整细胞密度为1～2×
106cells/mL
，加入抗原限制性表位多肽，终浓度为2～
10
μ
g/mL
，
37℃
负载3～
6h
；
(3)
将负载抗原肽的
DC
细胞与患者
PBMC
混合培养，
DC
细胞与
PBMC
的数量比为1：
10
～1：
100
，并向培养体系中加入
IL
‑2，终浓度为
200
～
1000IU/mL
；
(4)
培养过程中，每隔2～3天取样计数，用完全培养基补液或传代，维持细胞浓度为
0.5
～2×
106cells/mL
；
(5)
在第7天和第
14
天，重复步骤
(2)、(3)
取
DC
细胞负载抗原多肽，向培养体系中补加负载抗原肽的
DC
细胞，负载抗原肽的
DC
细胞与培养体系中细胞的数量比为1：
10
～1：
100
，于第
20
～
21
天收集细胞，获得特异性杀伤细胞
CTL
；所述步骤
(1)
和步骤
(2)
不区分先后顺序
。2.
如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原限制性表位多肽包括黑色素瘤分化抗原
MART
‑1限制性表位多肽或甲型流感病毒
M1
蛋白的限制性表位肽，其由体外合成获得，其
HLA
分型包括：
HLA
‑
A*02:01
；所述黑色素瘤分化抗原
MART
‑1限制性表位多肽具有：
(I)、
如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列；或
(II)、
在如
(I)
所示的氨基酸序列的基础上经取代
、
缺失
、
添加和
/
或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(III)、
与如
(I)
或
(II)
所示的氨基酸序列同源性
90
％以上的序列；所述甲型流感病毒
M1
蛋白的限制性表位肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：田光启，刘书磊，
申请(专利权)人：北京惠大生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：