本发明专利技术公开了一种抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体，以原核表达制备重组的Ｐ３０可溶性抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，利用杂交瘤技术经融合、筛选、克隆，获得能稳定分泌抗非洲猪瘟病毒Ｐ３０蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明专利技术也公开了用该细胞系制备单克隆抗体、抗体提纯方法及该抗体的辣根过氧化酶标记法。该单克隆抗体可用于猪血清中非洲猪瘟病毒抗体的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术及细胞工程领域，涉及分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交 瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体，以及所述单克隆抗体的纯化和辣根过氧化物酶标记，可 应用于检测猪血清中非洲猪瘟病毒抗体。
技术介绍
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一 种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100%，临 床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、 /K月中及脏器出血。(Wi lliam, Hess Adv. African swine fever a reassessment . Vet Sci Comp Med，1981，25 :39 69)世界动物组织(ΟΙΕ)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾 病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2) :117 119)。本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先 后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛 仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007 年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五 次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。 但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表 明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类 委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其 基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb 190kb，中央 有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加 或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafael，Yancz, Javier Μ, et al. Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus· Virology, 1995，208 249 279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分 泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个 0RF，可以编码150 200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多 肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998,28(11) :42 43)。非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白 具有免疫原性。实验证明，P30蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量约为36KD。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分泌特异性识别非洲猪瘟病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本专利技术的另一目的是提供上述细胞系分泌的抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体，所述单抗对非洲猪瘟结构蛋白P30抗原有较好的特异性。本专利技术的另一目的是提供上述抗体的纯 化及辣根过氧化酶标记的酶标记物。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种抗非洲猪瘟病毒单克隆 抗体的杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为CGMCCN0. 3771。所述的杂交瘤细胞系是通过杂交瘤技术以原核表达的重组可溶性蛋白P30作为 免疫原建立的。所述杂交瘤细胞系分泌的抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体。所述的单克隆抗体纯化后经过碘酸钠法制备辣根过氧化物的酶标记物。本专利技术的有益效果是该专利技术所制备的杂交瘤细胞株ASFV :P30Mab及其分泌的单 克隆抗体能够识别ASFV天然抗原，所获得的单克隆抗体不仅在ASFV基础研究，而且在ASFV 抗原抗体免疫反应的检测试剂中均具有很高的实用价值。附图说明图1为重组P30蛋白纯化后SDS-PAGE图。图2为重组P30蛋白纯化后western blotting图。具体实施例方式抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心CGMCC NO. 3771，保藏日2010-04_22，分类命名杂交瘤细胞株。下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明本专利技术的技术方案如下一、建立细胞系1.抗原制备a)非洲猪瘟P30蛋白的表达根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)P30基因序列，设计合成了 1对引物，采用PCR方 法从ASFV DNA中扩增出P30基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒 PET-P30，测序验证后转化入表达宿主菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达。设计的引物为P30-1-5，-GCGGATCCTAATTTTAAAATTGAATGGAT-3 ‘P30-2-5，-GTCTCGAGCCCAATCAAAATTAGATAACT-3 ‘下划线部分为引入的酶切位点，P30-1为ASFV P30基因上游扩增引物，引入的酶 切位点为BamHI ；P30-2为ASFV P30基因下游扩增引物，引入的酶切位点为Xhol。b)非洲猪瘟P30蛋白的纯化诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声ls，间隔 ls，共IOmin)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用 镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备 较好的抗原性(见附图1，2)。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，标准品浓度及其对应的OD 值见表1。纯化后P30蛋白的OD值为2. 25，与标准品比较后，其浓度为1700μ g/ml。<table>table see original document page 5</column></row><table>次基础免疫皮下注射抗原200 μ g，使用完全弗氏佐剂；每隔3周进行一次免疫，共三次， 50μ g/只/次，最后一次基础免疫后3周后脾内注射加强免疫，25 μ g/只，免疫完成。3.杂交瘤细胞的制备a)饲养细胞的制备以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。融合前1天，将小鼠拉颈处死，体表 消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用 注射器注射IOml RPMI 1640培养液至腹腔，反复冲洗，回收冲洗液，1000r/min离心10分 钟，弃上清。用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬沉淀，调整细胞浓度为2XlO5Ail。 将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0. 1ml，置37°C，6% CO2的培养箱中培养过夜。b)免疫脾细胞的制备取免疫完成后的BALB/c小鼠，通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟， 无菌条件下取出脾脏，至于平皿中，RPMI 1640培养液清洗1次。将脾脏移入另一盛有IOml R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系的保藏号为ＣＧＭＣＣ ＮＯ．３７７１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董志珍，侯艳梅，肖妍，赵祥平，王涛，张瑞，杨新梅，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。