结核分枝杆菌多抗原融合蛋白及编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌多抗原融合蛋白及编码基因和应用

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌多抗原融合蛋白及编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种结核分枝杆菌多抗原融合蛋白及编码基因和应用
。

技术介绍

[0002]虽然卡介苗在儿童应用中对肺外侵袭性结核病提供了较为理想的保护效果，但其在婴幼儿期间诱导的保护性免疫会随年龄增长而衰退，导致无法预防青少年和成年人群感染
Mtb。
卡介苗对青少年及成年人群的保护力下降，可能是导致结核病广泛传播的主要原因之一
。
因此，开发一种可以在青少年及成年人群提供较高保护效果的新型结核疫苗被视为全球结核防治任务中的首要任务
。
[0003]已有研究表明在成年人群中进行卡介苗的复种并不能增强其预防效果，进一步说明我们对新型结核疫苗开发的需求
。
目前新型结核疫苗的类型主要包括重组卡介苗
、
佐剂蛋白质亚单位疫苗
、
病毒载体疫苗
、DNA
疫苗
、
灭活疫苗等
。
其中佐剂蛋白质亚单位疫苗
、
病毒载体疫苗
、DNA
疫苗由于自身特性的限制仅可携带有限数量的抗原，无法诱导全面的针对更多抗原的免疫反应
。
因此其在临床上的使用主要用于卡介苗的加强接种
。MVA85A
病毒载体疫苗的临床试验结果显示，虽然
MVA85A
可以在人体中诱导强劲的
Th1
型免疫反应，但其作为
BCG/>的加强疫苗并没有展现出较单独接种
BCG
更好的保护效果
。
而灭活疫苗虽然在一定程度上保证了其安全性，但由于其不可定植复制的特性，在免疫功能正常人群中的诱导保护性免疫的能力可能较弱
。
目前仍然没有任何一种新型结核疫苗展现出远超卡介苗的保护效果
。
[0004]以卡介苗为载体构建表达结核分枝杆菌相关抗原的重组卡介苗是目前新型结核疫苗开发研究中一条重要策略
。
其中，选择有效的保护性结核分枝杆菌相关抗原组合是开发新型重组卡介苗的关键
。
目前，阻碍高效新型结核疫苗开发的最大障碍是我们仍未明确何类免疫可在人体中发挥长效的抗结核保护
。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0006]有鉴于
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白由
Rv3875
蛋白抗原
、Rv3874
蛋白抗原和
nRV0350
蛋白抗原组成，所述
nRV0350
蛋白抗原的氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0007]在前期对结核分枝杆菌的潜在有效抗原研究和筛选过程中发现，
Rv3875
蛋白抗原（即
ESAT
‑6）
、Rv3874
蛋白抗原（即
CFP
‑
10
）和
RV0350
蛋白（即
DnaK
）均为结核分枝杆菌的优势抗原，能够诱导产生保护性免疫反应
。
因此，本专利技术选用
ESAT
‑
6、CFP
‑
10、DnaK
作为构建重组卡介苗疫苗的潜在候选抗原组分
。
[0008]本专利技术使用
TEpredict
和
IEDB
等生物信息学分析平台对结核分枝杆菌抗原
Rv0350
即
DnaK
蛋白进行
T
细胞表位预测，选择一段长度为
122
个氨基酸的
DnaK
蛋白肽链
T
细胞表位集中区
new DnaK(nDnaK)
，并获得对应长度为
366
个碱基对的编码表位集中区
nDnaK
的核苷酸链
Rv0350
‑
366
，并命名为
new Rv0350(nRv0350)。nRv0350
编码蛋白（即
nRV0350
蛋白抗原）的氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0009]本专利技术所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白由
Rv3875
蛋白抗原
、Rv3874
蛋白抗原和
nRV0350
蛋白抗原组成
。
三种蛋白抗原均能针对结核分枝杆菌诱导产生保护性免疫反应，且
nRV0350
蛋白抗原作为潜伏期抗原，与另外两种早期分泌抗原组合构成融合蛋白，更有益于防止青少年以及成年人群中结核的新发感染或潜伏感染的再激活
。
[0010]本专利技术首次将抗原
DnaK
作为结核分枝杆菌的主要疫苗组分，实验表明，本专利技术提供的融合蛋白表现出良好的免疫原性，可以在小鼠中诱导比卡介苗更强的细胞免疫和体液免疫，具有长期的保护效果，且没有较卡介苗展现出更强的毒力
。
[0011]优选地，本专利技术所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0012]第二方面，本专利技术提供了编码所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0013]第三方面，本专利技术提供了用于表达所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的生物材料，所述生物材料选自表达载体
、
工程菌，所述生物材料包括核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的基因
。
[0014]优选地，所述生物材料为重组卡介苗
。
重组卡介苗以卡介苗为载体表达相关抗原，得以保留卡介苗原有的优势，例如：卡介苗可在婴幼儿中安全的接种；卡介苗在婴幼儿中对于侵袭性结核病的高保护性；卡介苗可诱导持久的抗原刺激；卡介苗内在佐剂活性；卡介苗易于生产且成本低廉等
。
因此，新型重组卡介苗的开发有广阔的前景
。
[0015]在本专利技术中，所述重组卡介苗的构建方法优选包括：
S1、
将所述基因连接至穿梭载体，得到携带有融合基因的重组质粒；
S2、
将步骤
S1
所述重组质粒转化入卡介苗，筛选得到稳定表达结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的重组卡介苗
。
[0016]优选地，所述穿梭载体为
pMV361
；和
/
或，所述卡介苗为
BCG
‑
China
菌株
。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，其特征在于，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白由
Rv3875
蛋白抗原
、Rv3874
蛋白抗原和
nRV0350
蛋白抗原组成，所述
nRV0350
蛋白抗原的氨基酸序列如
SEQ ID NO: 5
所示
。2.
根据权利要求1所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，其特征在于，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。3.
编码权利要求1或2所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。4.
用于表达权利要求1所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的生物材料，所述生物材料选自表达载体
、
工程菌，其特征在于，所述生物材料包括权利要求3所述基因
。5.
根据权利要求4所述生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组卡介苗；所述重组卡介苗的构建方法包括：
S1、
将权利要求3所述基因连接至穿梭载体，得到携带有融合基因的重组质粒；
S2、
将步骤
S1
所述重组质粒转化入卡介苗，筛选得到稳定表达结核分枝杆菌多抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：万康林，王瑞欢，刘海灿，范雪亭，李马超，方丹昂，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：