一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于荧光探针技术领域，具体涉及一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于荧光探针
，具体涉及一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]氨基肽酶
N(Aminopeptidase N
，
APN/CD13
，
EC 3.4.11.2)
是一种锌离子依赖性膜结合
II
型的金属跨膜糖蛋白，广泛存在于哺乳动物中并以同型二聚体的形式存在于质膜上，通过酶依赖性和非酶依赖性途径参与多种重要的生理功能，包括信号传导
、
神经肽降解
、
免疫反应和抗原处理等
。
此外，
APN
被广泛认为是髓系来源造血细胞的标记物，并通过其抗原性促进人类白血病细胞的分类；药物诱导的肝损伤
(DILI)
被认为是急性肝损伤的主要诱因，该疾病伴随着
APN
的异常表达；
APN
在肿瘤侵袭
、
血管再生和转移方面起着至关重要的作用，并在癌细胞中表现出增强的酶活性，故
APN
可作为癌症生物标记物用于评估和诊断癌症
。
鉴于
APN
重要的生理病理功能，开发具有高选择性和高灵敏性且可以实时检测
APN
的方法，将促进
APN
相关疾病的诊断和病理学研究
。
[0003]鉴于高的选择性
、
灵敏性和时空分辨率以及样品非破坏性等特点，荧光探针技术被广泛用于实时检测多种生理和病理过程，并在疾病诊断
、
外科手术方面发挥了重要的作用
。
另外，由于近红外光强的组织穿透性以及近红外区生物自发荧光低的特性，近红外荧光染料在肌肉
、
活体荧光影像时具有比可见区荧光染料更高的时空分辨率
。
然而，适合于活体成像的
APN
近红外荧光探针仅有少数被报道，因此迫切需要开发新型的
APN
近红外荧光探针
。

技术实现思路

[0004]本专利技术利用中心位酯基取代的五甲川花菁染料平台
(Cy5
‑
COOM)
，基于“酯基
→
羧基”转换策略开发了一个氨基肽酶
(APN)
荧光探针
Cy5
‑
APN
，该探针首先被癌细胞表面过量表达的
APN
水解，随后发生1，6‑
消除反应，最终释放出强荧光的中心位羧基取代的五甲川花菁染料
Cy5
‑
COO
，从而点亮癌细胞
。
细胞及活体实验证实，该探针可以高对比度区分癌细胞
/
组织和正常细胞
/
组织，因此在荧光引导的肿瘤手术中具有巨大的应用潜力
。
[0005]为达到上述目的本专利技术采用了以下技术方案：
[0006]一种氨基肽酶荧光探针，其结构式如下：
[0007][0008]一种氨基肽酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009][0010]步骤1，在
N2环境下，将
DMF
溶解于无水二氯甲烷，然后逐渐加入草酰氯，在室温下搅拌反应，反应完成后，在减压条件下充分蒸干溶剂，得到化合物1，为白色固体，其不经纯化直接用于下一反应；
[0011]步骤2，将化合物1和丙二酸单甲酯溶于无水二氯甲烷中，进行回流反应，在减压条件下蒸干溶剂后得到化合物2，向其中依次加入乙酸酐
、1
，2，3，3‑
四甲基
‑
3H
‑
吲哚碘化物和无水乙酸钠，进行搅拌反应，随后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥
、
减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物
Cy5
‑
COOM
，为深蓝色固体；
[0012]步骤3，将化合物
Cy5
‑
COOM
溶解在
MeOH
和
NaOH
的混合溶液中，进行搅拌反应，冷却后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥
、
减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物
Cy5
‑
COO
，为深蓝色固体；
[0013]步骤4，将
Cy5
‑
COO、
化合物3和碳酸钾溶解在无水
N,N
‑
二甲基甲酰胺中，进行搅拌反应，反应结束后冷却，用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机相并经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后重新溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液中，进一步搅拌反应后，经减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物
Cy5
‑
APN
，为深蓝色固体
。
[0014]进一步，所述步骤1中
DMF
和草酰氯的摩尔比为
30
：
35
，搅拌反应的时间为
2h。
[0015]进一步，所述步骤2中化合物1和丙二酸单甲酯的摩尔比为2：1，回流反应的温度为
40℃
，时间为过夜，化合物
2、1
，2，3，3‑
四甲基
‑
3H
‑
吲哚碘化物和无水乙酸钠的摩尔比为1：
2
：3，搅拌反应的温度为
90℃
，时间为
4h
，柱色谱分离纯化的展开剂为二氯甲烷
/
甲醇＝
10/1(v/v)。
[0016]进一步，所述步骤3中搅拌反应的温度为
43℃
，时间为
3h
，柱色谱分离纯化的展开剂为
10
‑
50
％甲醇
/
二氯甲烷
(v/v)。
[0017]进一步，所述步骤4中
Cy5
‑
COO、
化合物3和碳酸钾的摩尔比为1：3：2，搅拌反应的温度为
48℃
，时间为
3h
，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1：1，进一步搅拌反应的温度为室温，时间为
20
分钟，柱色谱分离纯化的展开剂为
CH2Cl2/MeOH
＝
8:1(v/v)。
[0018]一种氨基肽酶荧光探针的应用，可区分正常细胞
/
组织和癌细胞
/
组织，作为荧光影像试剂在荧光引导手术方面的应用
。
[0019]与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0020]目前开发的
APN
荧光探针，大都是基于荧光染料中氨基部分的保护与脱保护构建的，即
APN
与探针作用后改变了染料本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种氨基肽酶荧光探针，其特征在于，其结构式如下：
2.
一种权利要求1所述氨基肽酶荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，在
N2环境下，将
DMF
溶解于无水二氯甲烷，然后逐渐加入草酰氯，在室温下搅拌反应，反应完成后，在减压条件下充分蒸干溶剂，得到化合物1，为白色固体，其不经纯化直接用于下一反应；步骤2，将化合物1和丙二酸单甲酯溶于无水二氯甲烷中，进行回流反应，在减压条件下蒸干溶剂后得到化合物2，向其中依次加入乙酸酐
、1
，2，3，3‑
四甲基
‑
3H
‑
吲哚碘化物和无水乙酸钠，进行搅拌反应，随后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥
、
减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物
Cy5
‑
COOM
，为深蓝色固体；步骤3，将化合物
Cy5
‑
COOM
溶解在
MeOH
和
NaOH
的混合溶液中，进行搅拌反应，冷却后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥
、
减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物
Cy5
‑
COO
，为深蓝色固体；步骤4，将
Cy5
‑
COO、
化合物3和碳酸钾溶解在无水
N,N
‑
二甲基甲酰胺中，进行搅拌反应，反应结束后冷却，用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机相并经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后重新溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液中，进一步搅拌反应后，经减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物
Cy5
‑
APN
，为深蓝色固体
。3.
根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪星，劳观林，刘景，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：