白星花金龟在不同条件下稳定表达的内参基因组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了白星花金龟在不同条件下稳定表达的内参基因组合及其应用

【技术实现步骤摘要】
白星花金龟在不同条件下稳定表达的内参基因组合及其应用


[0001]本专利技术属于昆虫分子生物学
，尤其涉及白星花金龟在不同条件下稳定表达的内参基因组合及其应用
。

技术介绍

[0002]白星花金龟
Potosia brevitarsis Lewis
，属鞘翅目
(Coleoptera)
金龟科
(Scarabaeidae)
花金龟亚科
(Cetoniinae)
，是葡萄
、
苹果
、
玉米
、
番茄等农作物的重要害虫之一
。
该虫分布广泛，在中国
、
俄罗斯
、
朝鲜
、
日本
、
韩国等均有分布
。
在我国，大部分地区均有发生，包括新疆
、
山西
、
河北
、
河南等地
。
白星花金龟为一种多食性害虫，除危害葡萄
、
苹果
、
玉米
、
番茄等经济作物外，还危害啤酒花
、
杨树
、
柳树以及榆树等树木
。
有研究表明，白星花金龟危害超过
14
科
26
属
29
种植物，这对我国农业和林业的生产造成严重的威胁
。
目前对于白星花金龟的防治包括物理防治
、
化学防治
、
生物防治及农业防治等，但从分子水平对白星花金龟的研究相对较少
。
近年来，随着测序技术的快速发展，各种与发育
、
交配
、
能量代谢
、
觅食等生理过程相关的遗传信息基因被报道，研究这些基因的功能对于生物发育具有重要意义，对于开发针对这些基因的新型防治技术具有重要的意义
。
[0003]利用
qRT
‑
PCR
技术分析基因表达水平是现代分子生物学中的重要研究手段
。qRT
‑
PCR
因具有高通量
、
高灵敏度
、
准确定量等优点逐渐受到科研工作者的关注
。
为更准确定量靶标基因的含量，选择合适的内参基因至关重要
。
但大量研究表明，不同昆虫
、
不同实验条件
、
不同处理方法的变化会导致内参基因的类型和数量存在较大的差异
。
因此，筛选不同条件下的内参基因对后续内参基因的定量表达有重要的意义
。
然而，关于不同条件下的白星花金龟的基因选择未见相关报道
。
[0004]本专利技术以白星花金龟不同组织和不同温度处理的样品为实验材料，基于白星花金龟基因组数据
(GenBank:GCA_004143645.1)
及其他鞘翅目昆虫中已报道的内参基因序列信息，从中选取
10
个内参基因进行实验
。
利用
qRT
‑
PCR
技术，通过
Δ
Ct
法，
GeNorm
，
BestKeeper
，
NormFinder
和
RefFinder
软件对所得结果进行分析评估，获得白星花金龟在不同条件下稳定表达的内参基因组合
。
研究结果为白星花金龟在不同条件下筛选稳定表达的内参基因提供选择参考，也为其他昆虫内参基因筛选提供一定参考
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供白星花金龟不同组织和不同温度处理条件下稳定表达的内参基因组合及应用，所用筛选内参基因的方法能得到稳定表达的内参基因组合，能准确校正目的基因的表达情况
。
[0006]本专利技术的另一个目的在于提供一种白星花金龟内参基因筛选的方法，具体的实验方案如下：
[0007]1、
根据白星花金龟基因组结果，从中筛选出表达量高且稳定的候选内参基因，并设计
qRT
‑
PCR
引物
。
根据设计的
qRT
‑
PCR
引物，通过标准曲线和溶解曲线检测引物的性能，筛
选出扩增效率在
90
％
‑
110
％，相关系数
R2>0.99
，且溶解曲线显示单峰的引物用于后续实验
。
共筛选出
10
个内参基因，
10
个内参基因的引物序列
、
产物长度
、
引物扩增效率及相关系数如表1所示
。
[0008]表
1 10
个内参基因序列
qRT
‑
PCR
引物序列
、
产物长度
、
扩增效率及相关系数
[0009][0010]2、
收集白星花金龟不同组织和温度处理后的样品，并在无
RNA
酶的环境下提取总
RNA
，再利用反转录试剂盒转化为
cDNA。
利用
qRT
‑
PCR
技术检测不同样品中候选内参基因的表达量
。
随后根据各候选内参基因在各处理样本中的循环阈值
(Ct
值
)
，利用
GeNorm
，
BestKeeper
，
Δ
Ct
法和
NormFinder
进行基因稳定性评估
。
最后，通过
RefFinder
在线网站对所有候选内参基因进行综合比较与稳定性评估，给出综合的稳定性排名
。
利用
GeNorm
软件对各实验条件下的候选内参基因进行了配对变异性分析，以确定用于
qRT
‑
PCR
靶基因数据标准化的最佳内参基因数量
。
RNA Kit
试剂盒
(
全式金，北京
)
，提取步骤参照说明书
。
提取
RNA
后，用
1.0
％的琼脂糖凝胶电泳检测总
RNA
是否有降解，并用
NanoDrop 2000
检测
RNA
的纯度，随后保存在
‑
80℃
冰箱中
。RNA
经
NanoDrop 2000
检测后发现，样品的
260/280
在
1.95
～
2.10
之本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种白星花金龟在不同条件下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，在不同组织中稳定表达的内参基因组合
RPS3、RPL32
和
EF
；在不同温度处理条件下的内参基因组合为
RPS3、Actin
和
EF
，其中，
RP...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓芳，张涛，刘盼静，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：