一种5’制造技术

本发明专利技术公开了一种5’

【技术实现步骤摘要】
一种5
’
瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法


[0001]本专利技术涉及等温扩增方法
，尤其涉及一种5’
瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法
。

技术介绍

[0002]近年来分子生物学技术有了迅猛的发展，为了适应不同环境
、
不同样本及不同目的的检测需求，多种等温扩增方法应运而生；其中，环介导等温扩增技术即
LAMP
和交叉引物等温扩增技术即
CPA
是其中应用最广的两种方案；
[0003]其中
LAMP
方法是
Notomi
等于
2000
年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物，利用具有链置换特性的
Bst DNA
聚合酶，在
65℃
条件下高效
、
快速
、
高特异地扩增靶序列；
[0004]引物设计：针对靶基因3’
端的
F3c、F2c
和
Flc
区及5’
端的
B1、B2
和
B3
区6个特异位点设计4种引物，上游内引物
FIP
由
Flc
和
F2
组成，下游内引物
BIP
由
Blc
和
B2
组成，上游外引物
F3/>与
F3c
互补，下游外引物
B3
与
B3c
互补；
[0005]哑铃状模板构造的形成：
FIP
引物中的
F2
序列与模板
DNA
上
F2c
结合，在链置换
DNA
聚合酶的作用下向前延伸并启动链置换反应，外引物
F3
与模板
F3c
区域结合，共同置换出
FIP
延伸的单链，此单链上
F1C
与
F1
互补，碱基配对形成环状结构
。
以此链为模板，
BIP
引物与其结合并延伸，同时环状结构被打开
。
随后，
B3
在聚合酶作用下置换出新的互补链，被置换的单链两端均存在互补序列，可发生自我碱基配对形成哑铃状
DNA
结构；
[0006]扩增循环：以哑铃状结构为模板，
FIP
与其
F2c
区结合开始链置换合成，通过再循环和延伸得到长度不同的
DNA
产物
。
整个过程在
63℃
左右
45min
～
60min
即可完成，扩增流程如图1所示；
[0007]CAP
是
2008
年由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术
。
它针对目的基因4或5个区域设计4或者5条特异性引物，利用具有链置换特性的
Bst DNA
聚合酶
、
甜菜碱，在
63℃
左右条件下进行高效
、
快速
、
高特异地扩增靶序列
。
[0008]根据交叉引物数量的不同，
CPA
可分为双交叉扩增共4条引物＝2条交叉引物
+2
条剥离引物和单交叉扩增共5条引物＝1条交叉引物
+2
条剥离引物
+2
条普通引物；
CPA
在
63℃
左右进行，依赖
Bst DNA
聚合酶
、
甜菜碱和交叉引物，根据交叉引物数量的不同，可分为双交叉引物扩增和单交叉引物扩增；
[0009]双交叉引物扩增包括3对引物包含两条交叉引物
、
两条剥离引物和两条探针
、Bst DNA
聚合酶
、
甜菜碱及其他必要成分；正向交叉引物中的
1s
与模板互补序列结合，在链置换
DNA
聚合酶的作用下完成延伸，剥离引物
3s
将合成的
DNA
单链置换下来，反向交叉引物
2a
与其结合并延伸，经剥离引物
4a
置换，即可产生带有交叉引物位点的扩增产物，以带有交叉引物位点的扩增产物为模板，通过交叉引物和
DNA
聚合酶的循环杂交
、
延伸，就可得到大量重复带有交叉位点的扩增产物；
[0010]单交叉引物扩增体系中只有一条交叉引物，首先交叉引物中的
1s
与模板互补序列
结合延伸，剥离引物
4s
置换出新合成的单链，将
2a
引入到扩增产物中，在链置换
DNA
聚合酶作用下，以新合成的单链为模板，引入特异引物
3a、2a
，得到两条不同的单链
DNA
；
2a
和交叉引物分别与单链
DNA
产物迅速结合并延伸，形成两条不同长度的产物；以此产物为模版，引物
1s
或
3a、2a
与其结合
、
延伸，不断循环杂交，最终得到大量扩增产物，具体扩增流程如图2所示；
[0011]常规
PCR
技术存在以下缺陷：
(1)PCR
仪价格昂贵，对精良设备依赖度高；
(2)
影响扩增因素众多；
(3)
耗时较长等；因此限制了
PCR
技术在基层的推广使用；等温扩增技术是一类更具特色的核酸扩增技术，通过不同的酶和特异性引物在恒定温度下进行快速扩增，与
PCR
方法相比，等温扩增技术使用的仪器设备简单且扩增时间大大缩短，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景
。

技术实现思路

[0012]本专利技术目的是提供一种设计简单
、
特异性灵敏度高
、
假阳性低的等温扩增方法，以解决现有技术引物设计复杂
、
假阳性率高的问题
。
[0013]本专利技术解决技术问题采用如下技术方案：一种5’
瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法，包括含有目的基因识别位点的茎环状适配子引物序列
、
外源引物组等；所用酶包括
taq
酶
、Bst
酶等，整个方法步骤如下：
[0014]S1、
设计引物
[0015]针对目的基因设计引物，引物包含两对，分别为
A/B
和
C/D
；
[0016]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种5’
瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法，其特征在于，利用
Taq
酶的5’
瓣状核酸内切酶的特性，释放出互补配对的茎环状适配子引物；茎环状适配子引物之间互补扩增补齐缺口，在等温扩增酶和外源引物的作用下进行等温扩增，具体包括以下步骤：
S1、
设计引物：
a、
针对目的基因设计引物，引物包含两对，分别为
A/B
和
C/D
；
b、
所述
A/B
为外侧双向引物，引物长度为
10
‑
60nt
，用于锚定目的基因，扩增子长度不限；
c、
所述茎环状适配子引物包括三部分序列，自身成环的茎环结构
stem
‑
loop、
一段适配子区域
、3
’
端与目的基因识别的引物，所述3’
端与目的基因识别的引物即为引物
C/D
，除引物
C
和
D
外，其余序列在目的基因上没有识别区域，所述
A/B
引物序列与
C/D
茎环结构区域无识别区域；
d、
所述引物
C/D
位于外侧双向引物
A
和
B
的扩增区域内，分别识别双链
DNA
的两条链；两个茎环状适配子引物分别标记为
SLC
和
SLD
；
e、
所述两个茎环状适配子引物的适配子部分反向互补；
f、
所述茎环结构上设计等温扩增引物
SLP
；
g、
设计等温扩增引物：所述等温扩增引物长度为
10
‑
60nt
，与茎环结构部分区域反向互补；
S2、
目的基因识别及探针置换
、
延伸，形成双端茎环结构：
a、
获得需要检测的样本
DNA/RNA
即目的基因，
DNA
可直接用于后续检测，
RNA
需通过常见的反转录步骤获得对应
cDNA
后用于后续检测；
b、
所述
A/B
引物对识别目的基因位点，并结合在目的基因上，在
taq
酶的作用下开始扩增；
c、
所述
SLC
和
SLD...

【专利技术属性】
技术研发人员：李静，朱俊，查洋，蒋广志，陈金萨，
申请(专利权)人：上海宏序生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：