位点特异性基因组修饰技术制造技术

本公开提供了与模板介导的基因组编辑和修饰相关的组合物

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】位点特异性基因组修饰技术
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求享有
2021
年2月
15
日提交的美国临时专利申请号
63/149,419
的优先权和利益，其全部公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的
。
[0003]序列表
[0004]在此提交的计算机可读序列表文本，标题为“39212
‑
601_SEQUENCE_LISTING_ST25”，创建于
2022
年2月
14
日，文件大小为
144,908
字节，其全部公开内容通过引用整体并入本文
。
[0005]政府资助
[0006]本专利技术得到了政府的支持，由国家卫生研究院授予的拨款号为
GM119561。
政府对本专利技术享有一定的权利
。


[0007]本公开提供了与模板介导的基因组修饰相关的组合物
、
方法和系统
。
特别是，本公开提供了新的基因组修饰技术，该技术涉及核苷酸的位点特异性化学修饰以引入复制阻断损伤
。
本文所述的组合物
、
方法和系统促进了
DNA
靶标的高效位点特异性基因组修饰，同时最大限度地减少了与当前基因组编辑方法相关的意外编辑和细胞毒性
。

技术介绍

[0008]基于
CRISPR
的基因组编辑工具依靠其易于编程的目标和强大的活性，已经发现了广泛的应用
。
这些基于
CRISPR
的工具的早期使用集中在
Cas
核酸酶切割
DNA
的能力上
。
在修复切割的
DNA
的过程中，通过与提供的
DNA
修复模板的同源重组引入基因组编辑
。
然而，
DNA
断裂是毒性最大的细胞事件之一；
DNA
断裂触发细胞报警系统，导致突变
、DNA
重排或细胞活力丧失
。
随后的
CRISPR
‑
Cas
基因组编辑工具通过对单个碱基的靶向修饰或向导
RNA
内编码的短模板的整合来寻求替代方法
。
尽管如此，这些方法在可生成的编辑范围内受到限制，并且可能产生不希望的编辑
。
因此，需要一种高效的基因组编辑和修饰平台来克服当前系统的局限性
。
[0009]专利技术概述
[0010]本公开的实施方案包括用于靶向基因组修饰的组合物
。
根据这些实施方案，组合物包括缺口编辑器复合物，该复合物包含
DNA
识别结构域和
DNA
修饰结构域，其中
DNA
识别结构域结合基因组中的
DNA
靶序列，并且其中
DNA
修饰结构域诱导复制阻断部分在基因组中至少一个核苷酸上的形成
。
[0011]在一些实施方案中，组合物还包含供体核酸模板
。
在一些实施方案中，供体核酸模板包含来自与
DNA
靶序列相对应的内源性同源序列的多核苷酸
。
在一些实施方案中，供体核酸模板包含外源单链
DNA(ssDNA)
分子或双链
DNA(dsDNA)
分子
。
在一些实施方案中，供体核酸模板是
RNA
分子
。
在一些实施方案中，供体核酸模板的存在有利于同源定向缺口修复和
/
或重组，其中供体核酸模板或其片段被重组为
DNA
靶序列的基因组
。
[0012]在一些实施方案中，
DNA
识别结构域包含至少一个缺乏脱氧核糖核酸酶活性的
Cas
蛋白或其片段
。
在一些实施方案中，
DNA
识别结构域包含缺乏脱氧核糖核酸酶活性的
Cas
蛋白的复合物
。
在一些实施方案中，
DNA
识别结构域包含具有切口酶活性的
Cas
蛋白或其片段
。
在一些实施方案中，
Cas
蛋白或
Cas
蛋白复合物包含
I
型
Cascade、II
型
Cas9、IV
型效应模块
(effector module)、V
型
Cas12、Cas9
相关的
IscB、Cas9
相关的
TnpB
，及其组合
。
[0013]在一些实施方案中，
DNA
识别结构域和
DNA
修饰结构域功能性偶联
。
在一些实施方案中，功能性偶联包括多肽融合物
、
肽标签
、
肽接头
、RNA
标签，及其任意组合
。
[0014]在一些实施方案中，
DNA
修饰结构域通过将复制阻断部分添加至以下核苷酸来阻断
DNA
复制
:(i)
与
DNA
靶序列互补的
DNA
链中的至少一个核苷酸；
(ii)
含有
DNA
靶序列的
DNA
链中的至少一个核苷酸；或
(iii)
与
DNA
靶序列互补的
DNA
链中的至少一个核苷酸和含有
DNA
靶序列的
DNA
链中的至少一个核苷酸
。
[0015]在一些实施方案中，
DNA
识别结构域诱导
DNA
靶链中的单链断裂，并且
DNA
修饰结构域将复制阻断部分添加至与
DNA
靶序列互补的
DNA
链中的至少一个核苷酸上
。
[0016]在一些实施方案中，
DNA
修饰结构域被工程化为具有降低的
DNA
结合
、
增加的对单链
DNA
的特异性，和
/
或降低的酶活性
。
[0017]在一些实施方案中，
DNA
修饰结构域催化
ADP
核糖添加至胸腺嘧啶或鸟嘌呤核苷酸上
。
在一些实施方案中，
DNA
修饰结构域包含
DarT
酶或其功能片段
、
衍生物或变体
。
在一些实施方案中，
DNA
修饰结构域包含催本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
用于靶向基因组修饰的组合物，所述组合物包含缺口编辑器复合物，所述复合物包含
DNA
识别结构域和
DNA
修饰结构域，其中所述
DNA
识别结构域结合所述基因组中的
DNA
靶序列，并且其中所述
DNA
修饰结构域诱导复制阻断部分在所述基因组中至少一个核苷酸上的形成
。2.
权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含供体核酸模板
。3.
权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述供体核酸模板包含多核苷酸，所述多核苷酸来自与所述
DNA
靶序列相对应的内源性同源序列
。4.
权利要求2所述的组合物，其中所述供体核酸模板包含外源单链
DNA(ssDNA)
分子
、
双链
DNA(dsDNA)
分子
、
或
RNA
分子
。5.
权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述供体核酸模板的存在促进了同源定向缺口修复和
/
或重组，其中所述供体核酸模板或其片段被重组为所述
DNA
靶序列的基因组
。6.
权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一个向导
RNA
分子
。7.
权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
识别结构域包含至少一个缺乏脱氧核糖核酸酶活性的
Cas
蛋白或其片段
。8.
权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
识别结构域包含缺乏脱氧核糖核酸酶活性的
Cas
蛋白复合物
。9.
权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
识别结构域包含具有切口酶活性的
Cas
蛋白或其片段
。10.
权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述
Cas
蛋白或
Cas
蛋白复合物包含
I
型
Cascade、II
型
Cas9、IV
型效应模块
(effector module)、V
型
Cas12、Cas9
相关的
IscB、Cas9
相关的
TnpB
，及其组合
。11.
权利要求1至
10
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
识别结构域和所述
DNA
修饰结构域功能性偶联
。12.
权利要求
11
所述的组合物，其中功能性偶联包括多肽融合物
、
肽标签
、
肽接头
、RNA
标签，及其任意组合
。13.
权利要求1至
12
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域通过将所述复制阻断部分添加至以下核苷酸来阻断
DNA
复制：
(i)
与所述
DNA
靶序列互补的
DNA
链中的至少一个核苷酸；
(ii)
包含所述
DNA
靶序列的
DNA
链中的至少一个核苷酸；或
(iii)
与所述
DNA
靶序列互补的
DNA
链中的至少一个核苷酸和包含所述
DNA
靶序列的
DNA
链中的至少一个核苷酸
。14.
权利要求1至
13
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
识别结构域诱导
DNA
靶链中的单链断裂，并且其中所述
DNA
修饰结构域将所述复制阻断部分添加至与所述
DNA
靶序列互补的
DNA
链中的至少一个核苷酸
。15.
权利要求1至
14
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域被工程化为具有减少的
DNA
结合
、
增加的对单链
DNA
的特异性，和
/
或降低的酶活性
。16.
权利要求1至
15
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域催化
ADP
核糖添加至胸腺嘧啶或鸟嘌呤核苷酸
。
17.
权利要求1至
16
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构结构域包含
DarT
酶或其功能片段
、
衍生物或变体
。18.
权利要求
16
或权利要求
17
所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域包含催化结构域，所述催化结构域与
SEQ ID NO:18
‑
21
中的任一个具有至少
70
％的氨基酸序列同一性
。19.
权利要求
17
或权利要求
18
所述的组合物，其中所述
DarT
酶包含下列氨基酸取代中的一个或多个：
G49D、K56A、M86L、R92A
和
/
或
R193A。20.
权利要求1至
16
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域包含
Scabin
酶或其功能片段
、
衍生物或变体
。21.
权利要求
16
或
20
所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域包含催化结构域，所述催化结构域与
SEQ ID NO:22
‑
24
中的任一个具有至少
70
％的氨基酸序列同一性
。22.
权利要求
20
或权利要求
21
所述的组合物，其中所述
Scabin
酶包含氨基酸取代
K130A。23.
权利要求1至
15
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域催化腺嘌呤核苷酸的甲基氨甲酰化
。24.
权利要求
23
所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域包含
Mom
酶或其功能片段
、
衍生物或变体
。25.
权利要求
23
或权利要求
24
所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域包含催化结构域，所述催化结构域与
SEQ ID NO:25
‑
27
具有至少
70
％的氨基酸序列同一性
。26.
权利要求
24
或权利要求
25
所述的组合物，其中所述
Mom
酶包含氨基酸取代
D149A。27.
权利要求1至
14
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域催化选自下组的复制阻断部分的添加
:
葡萄糖
、
苏氨酰氨甲酰腺苷
、
醋酸酯
、
甘油
、L
‑
抗坏血酸
、
尿苷
、
单磷酸腺苷
、
脂质
、
氨基酸
、
胍基丁胺
、L
‑
苏氨酰氨甲酰腺苷酸
、L
‑
苏氨酰氨甲酰
、
甲基硫醇盐
、
硫
、
甲基
、S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸或
S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸的亚基团
、
和二甲基烯丙基二磷酸或其亚基团
。28.
权利要求1至
14
中任一项所述的组合物，其中所述
DNA
修饰结构域包含选自下组的酶或其功能片段
、
衍生物或变体：
Pierisin、Scabin、
细胞周期和凋亡调节蛋白
1(CARP
‑
1)、SCO5461
蛋白
(ScARP)、
腺嘌呤修饰酶
、
乙酰转移酶
、
氨基酸转移酶
、
核苷酸转移酶
、
尿酰基转移酶
、
酰基转移酶
、ADP
‑
核糖基转移酶
、
甲硫基转移酶
、N
‑
乙酰转移酶
10、tRNA(Met)
胞苷乙酰转移酶
(TmcA)、tRNA
胞苷乙酰转移酶
、GCN5
相关
N
‑
乙酰转移酶
、
赖胞苷合酶
、m7G
甲基转移酶
、N6
氨甲酰甲基转移酶
(Mom)、N6
‑
腺苷苏氨酰氨甲酰转移酶
、
苏氨酰氨甲酰转移酶或苏氨酰氨甲酰转移酶复合物
、TsaB
‑
TsaE
‑
TsaD(TsaBDE)
复合物
、tRNAN6
‑
腺苷苏氨酰氨甲酰转移酶
(Qri7,Tcs4)、
甲基转移酶
、ATrm5a、tRNA:m1G/imG2
甲基转移酶
、tRNA(
腺苷
(37)
‑
N6)
‑
二甲基烯丙基转移酶
、tRNA
二甲基烯丙基转移酶
(MiaA)
和异戊烯基转移酶
。29.
权利要求6至
28
中任一项所述的组合物，其中所述至少一个向导
RNA
包含
gRNA、sgRNA、crRNA
或其任意组合
。30.
权利要求6至
29
中任一项所述的组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学，
类型：发明
国别省市：