一种滇重楼来源细胞外囊泡及其分离提取方法与应用技术

本发明专利技术公布了一种滇重楼来源细胞外囊泡及其分离提取方法与应用，属于分子生物学及生物医学技术领域；所述方法为先将滇重楼块茎研磨，获得滇重楼块茎汁液，通过多次低速离心去除大颗粒滇重楼组织，同时通过8％

【技术实现步骤摘要】
一种滇重楼来源细胞外囊泡及其分离提取方法与应用


[0001]本专利技术设计分子生物学及生物医学
，尤其涉及一种分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法
。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡
(extracellular vesicles
，
EVs)
是大多数细胞天然分泌的含有磷脂双分子层结构的纳米级囊泡，它可以在细胞与细胞之间来回穿梭，行使细胞间物质交换
、
信息交流的功能，是细胞间的通讯的重要媒介
。
植物细胞外囊泡具有体积小，穿透性强，在不同的温度
、
酸碱度下都能维持较好生物活性
。
植物外泌体由于功能多样性而被广泛应用于药物递送
。
外泌体载药不仅能提高药物的传递效率，而且还能实现药物的靶向性，使药物更好的发挥药物疗效
。
与动物细胞来源的外泌体不同，植物外泌体来源广泛能从很多植物中天然的外泌体
。
并且植物外泌体比动物外泌体更加安全，可以避免动物个体之间的疾病传播
。
[0003]滇重楼
(Paris polyphylla var.yunnanensis)
为百合科重楼属云南重楼的根茎
。
性微寒，味苦，归肝经
。
具有清热解毒
、
消肿止痛
、
凉肝定惊之功效
。
临床用于疔疮肿痛
、
咽喉肿痛
、
蛇虫咬伤r/>、
跌打伤痛
、
惊风抽搐
。
滇重楼主要含有重楼皂苷
I、
重楼皂苷
II、
黄酮类
、
多糖等化学成分
。
现代药理研究表示滇重楼具有良好的抗炎
、
抗菌
、
抗氧化尤其是抗肿瘤作用明显，对肝癌
、
肺癌
、
胃癌
、
乳腺癌
、
结肠癌等多种肿瘤细胞有抑制作用
。
目前滇重楼来源的细胞外囊泡
(PP
‑
EVs)
尚未见报道，因此如何有效提取滇重楼细胞外囊泡和其应用研究具有重要价值
。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供的技术方案通过
PEG
沉淀分离滇重楼细胞外囊泡，再结合蔗糖梯度离心纯化的方法分离提取了滇重楼细胞外囊泡
。
以解决目前滇重楼细胞外囊泡分离提取的空白
。
[0005]为实现上述目的，实验方案如下：
[0006]一种分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]步骤
(1)
：将滇重楼须根去除，将块茎洗净晾干水分；
[0008]步骤
(2)
：将步骤
(1)
晾干水分的滇重楼块茎切碎，加
PBS
研磨后过滤，弃去滤渣，收集滤液；
[0009]步骤
(3)
：将步骤
(2)
所得滤液在离心力
500g
～
1000g
，3‑
8℃
离心
10
～
15
分钟，再取上清液在离心力
2000g
～
3000g
，3‑
8℃
离心
20
～
25
分钟，离心结束，再次收集上清液；
[0010]步骤
(4)
：将步骤
(3)
所得上清液在离心力
10000g
～
13000g
，3‑
8℃
离心
25
～
30
分钟，取上清液加8％
PEG8000
，过夜沉淀，收集滤液；
[0011]步骤
(5)
：将步骤
(4)
所得滤液在离心力
13000g
～
15000g
，3‑
8℃
离心
25
～
30
分钟，弃上清液，加
PBS
吹打混悬；
[0012]步骤
(6)
：向步骤
(5)
所得混悬液加入质量浓度为8％～
60
％梯度的蔗糖溶液中；再在离心力
140000g
～
160000g
，3‑
8℃
离心
1.5
～2小时；
[0013]步骤
(7)
：将步骤
(6)
蔗糖溶液中的细胞外囊泡条带吸出，向细胞外囊泡条带中加入细胞外囊泡体积条带
10
倍体积的
PBS
，在离心力
100000g
～
150000g
，3‑
8℃
离心
1.5
～2小时，收集沉淀加入
PBS
重悬，再在离心力
100000g
～
150000g
，3‑
8℃
离心1～
1.5
小时；
[0014]步骤
(8)
：收集步骤
(7)
所得沉淀，并且加入
PBS
重悬后，过滤收集滤渣，灭菌后冻干保存
。
[0015]进一步的，上述的分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，步骤
(2)
中滇重楼块茎与
PBS
质量体积比为
1g
：1‑
3ml。
[0016]进一步的，上述的分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，步骤
(3)
所述的离心具体为：在离心力
1000g
，
4℃
离心
10
分钟，再取上清液再在离心力
3000g
，
4℃
离心
20
分钟，收集上清液
。
[0017]进一步的，上述的分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，所述步骤
(4)
的离心具体为：在离心力
12000g
，
4℃
离心
30
分钟，再向上清液中加入8％
PEG
对滇重楼细胞外囊泡沉淀
12
小时
。
[0018]进一步的，上述的分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，所述的上清液和8％
PEG
的体积比为5：
1。
[0019]进一步的，上述的分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，所述步骤
(5)
的滤液离心是在离心力
15000g...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤
(1)
：将滇重楼须根去除，将块茎洗净晾干水分；步骤
(2)
：将步骤
(1)
晾干水分的滇重楼块茎切碎，加
PBS
研磨后过滤，弃去滤渣，收集滤液；步骤
(3)
：将步骤
(2)
所得滤液在离心力
500g
～
1000g
，3‑
8℃
离心
10
～
15
分钟，再取上清液在离心力
2000g
～
3000g
，3‑
8℃
离心
20
～
25
分钟，离心结束，再次收集上清液；步骤
(4)
：将步骤
(3)
所得上清液在离心力
10000g
～
13000g
，3‑
8℃
离心
25
～
30
分钟，取上清液加8％
PEG8000
，过夜沉淀，收集滤液；步骤
(5)
：将步骤
(4)
所得滤液在离心力
13000g
～
15000g
，3‑
8℃
离心
25
～
30
分钟，弃上清液，加
PBS
吹打混悬；步骤
(6)
：向步骤
(5)
所得混悬液加入质量浓度为8％～
60
％梯度的蔗糖溶液中；再在离心力
140000g
～
160000g
，3‑
8℃
离心
1.5
～2小时；步骤
(7)
：将步骤
(6)
蔗糖溶液中的细胞外囊泡条带吸出，向细胞外囊泡条带中加入细胞外囊泡体积条带
10
倍体积的
PBS
，在离心力
100000g
～
150000g
，3‑
8℃
离心
1.5
～2小时，收集沉淀加入
PBS
重悬，再在离心力
100000g
～
150000g
，3‑
8℃
离心1～
1.5
小时；步骤
(8)
：收集步骤
(7)
所得沉淀，并且加入
PBS
重悬后，过滤收集滤渣，灭菌后冻干保存
。2.
根据权利要求1所述的分离提取滇重楼来源细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭杰，唐钧泽，何燕，叶慧玲，程欣，冯振振，曹桂宁，冉智力，董嘉鹏，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：