一种将制造技术

本发明专利技术公开了一种将

【技术实现步骤摘要】
一种将ND
‑
FISH与GISH结合的百合杂交种鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物基因工程检测
，具体涉及一种将
ND
‑
FISH
与
GISH
结合的百合杂交种鉴定方法
。

技术介绍

[0002]百合
(Lilium.spp)
是一类具有很高观赏价值和经济价值的植物，其花朵美丽
、
花期较长，是世界上重要的切花和花卉市场品种之一
。
百合的良种繁育是提高其观赏品质和经济价值的关键，杂交是一种常见的育种手段，通过将具有优良性状的亲本进行杂交，可以创造出更多具有优良性状的新品种
。
为了确保杂交品种的品质及其亲本的来源，对杂交种进行准确鉴定是至关重要的
。
[0003]目前，对于百合杂交种的鉴定方法主要有形态学观察
、
生化方法
(
如同工酶分析
)、
分子生物学方法
(
如分子标记技术
)。
然而，这些方法存在一定的局限性，如形态学观察容易受环境因素影响，同工酶分析和分子标记技术可能无法区分某些近缘杂交种
。
而传统的染色体研究方法如核型分析
、
染色体计数等，虽然可以了解植物的染色体基本特征，但在杂交种鉴定方面存在局限性，如无法区分百合染色体中大量的近端染色体，且对制备染色体技术要求较高
。
随着分子生物学技术的发展，/>FISH(FluorescenceInSituHybridization)
和
GISH(GenomicInSituHybridization)
等染色体分子标记技术应运而生
。
这些技术具有较高的灵敏度和特异性，可以在细胞和染色体水平上对植物进行精确鉴定
。
[0004]目前在百合杂交种的细胞学鉴定方面，仍然是以
FISH
和
GISH
为主，普遍认为
GISH
技术更加适用于百合组间杂交的后代鉴定
。FISH
技术主要包括探针提取与合成
、
探针标记
、
杂交
、
洗涤和观察，现有的
FISH
技术主要的缺点体现在技术繁琐
、
时间花费长
、
成本高等
。FISH
技术需要通过引物提取出需要的
DNA
片段，并采用缺刻平移法等对该片段进行标记，杂交过程复杂且花费大量时间和精力，且染色体在通过高温变性后不能再次使用，因此在标记大量探针的情况下会进行大量的重复工作，还因为染色体在
FISH
技术会高温变性而无法和
GISH
技术联合使用
。
而单一的
FISH
技术只能观测到同一分裂相中的标记染色体无法观测到到重组现象，单一的
GISH
染色体也只能检测到同一分裂相中的重组染色体，无法观察到其中的标记染色体
。
染色体由于制片技术的差异，染色体的形状和大小都会出现变化，且百合中存在大量的近端染色体，因此在百合染色体中，近端染色体很难通过染色体测量技术进行识别
。
以上两种技术单独使用时均不能准确判断染色体的来源，且无法进行染色体定位，百合杂交种的鉴定技术亟待克服上述问题
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述问题，本专利技术提供一种将
ND
‑
FISH
与
GISH
结合的百合杂交种鉴定方法，以解决现有百合杂交种鉴定技术不能准确判断染色体的来源
、
无法进行染色体定位的技术难题
。
[0006]本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种将
ND
‑
FISH
与
GISH
结合的百合杂交种鉴定方法，用于百合组间杂交种的鉴定，包括如下步骤：
[0008](1)
发根及预处理：剪取待检测百合的根，并置于有孔且湿润的离心管中，采用笑气处理2～
3h
后，加入
90
％醋酸并于冰上固定
10
‑
15min
，固定后的根用
ddH2O
清洗3～5次，加入
70
％酒精，于
‑
20℃
冰箱保存备用；
[0009](2)
采用根尖中期细胞染色体进行制片：将步骤
(1)
中保存的根取出，用
ddH2O
清洗3‑5次，加入适量
ddH2O
保持根的湿润状态，使用镊子将根取出并于滤纸上吸干水分，用刀片切下根尖分生区组织，放入预先准备好的2％纤维素酶和1％果胶酶混合液中，
35
～
40℃
水浴
50
～
60min
，酶解后的根尖立即转移到冰上放置，用
70
％酒精洗3～5次，再加入
100
μ
L
的
70
％酒精，然后使用电动组织研磨器将根尖磨碎，
3500r/min
离心
3min
，倒掉酒精，倒扣于纸上晾干剩余酒精；接合管内根尖数，按照每个1个根尖加
28
μ
L
冰醋酸的加料比加入冰醋酸，并且涡旋充分混匀；取
10
μ
L
悬液滴在洁净载玻片上，并置于已经用水喷湿的片盒中自然晾干；然后在普通相差显微镜下观察有丝分裂中期细胞染色体，并用铅笔在载玻片侧面标记好分裂相的位置，保留分裂相较好的玻片；用紫外交联仪进行交联后，应用塑封袋包装好后，置于
‑
20
～
4℃
冰箱保存；
[0010](3)ND
‑
FISH
鉴定：在已知目的基因的前提下，选取重复序列选择
30
‑
57bp
作为寡核苷酸探针序列，并利用
TAMRA
或
FAM
荧光基团在5’
端进行修饰得到探针干粉，将探针干粉于
12000r/min
离心
3min
，按照
1OD
加
100
μ
L1
×
TE
溶液的加料比加1×
TE
溶液进行溶解，得到
100
×
的探针原液，然后用2×
SSC
：1×
TE
＝
1:1Buffer
将
100
×
探针原液稀释成
1000
×
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种将
ND
‑
FISH
与
GISH
结合的百合杂交种鉴定方法，用于百合组间杂交种的鉴定，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
发根及预处理：剪取待检测百合的根，并置于有孔且湿润的离心管中，采用笑气处理2～
3h
后，加入
90
％醋酸并于冰上固定
10
‑
15min
，固定后的根用
ddH2O
清洗3～5次，加入
70
％酒精，于
‑
20℃
冰箱保存备用；
(2)
采用根尖中期细胞染色体进行制片：将步骤
(1)
中保存的根取出，用
ddH2O
清洗3‑5次，加入适量
ddH2O
保持根的湿润状态，使用镊子将根取出并于滤纸上吸干水分，用刀片切下根尖分生区组织，放入预先准备好的2％纤维素酶和1％果胶酶混合液中，
35
～
40℃
水浴
50
～
60min
，酶解后的根尖立即转移到冰上放置，用
70
％酒精洗3～5次，再加入
100
μ
L
的
70
％酒精，然后使用电动组织研磨器将根尖磨碎，
3500r/min
离心
3min
，倒掉酒精，倒扣于纸上晾干剩余酒精；接合管内根尖数，按照每个1个根尖加
28
μ
L
冰醋酸的加料比加入冰醋酸，并且涡旋充分混匀；取
10
μ
L
悬液滴在洁净载玻片上，并置于已经用水喷湿的片盒中自然晾干；然后在普通相差显微镜下观察有丝分裂中期细胞染色体，并用铅笔在载玻片侧面标记好分裂相的位置，保留分裂相较好的玻片；用紫外交联仪进行交联后，应用塑封袋包装好后，置于
‑
20
～
4℃
冰箱保存；
(3)ND
‑
FISH
鉴定：在已知目的基因的前提下，选取重复序列选择
30
‑
57bp
作为寡核苷酸探针序列，并利用
TAMRA
或
FAM
荧光基团在5’
端进行修饰得到探针干粉，将探针干粉于
12000r/min
离心
3min
，按照
1OD
加
100
μ
L 1
×
TE
溶液的加料比加1×
TE
溶液进行溶解，得到
100
×
的探针原液，然后用2×
SSC
：1×
TE
＝
1:1Buffer
将
100
×
探针原液稀释成
1000
×
的寡核苷酸探针工作液备用；根据杂交体系，取对应量的寡核苷酸探针工作液加入
Buffer
中，充分混匀，以制成探针杂交液，将
10
μ
L
探针杂交液滴加到玻片上有分裂相的区域，迅速盖上盖玻片，放进提前预热好的湿润密闭铝盒中，置于
42℃
恒温培养箱中杂交
2h
；杂交后的玻片用
42℃
预热的2×
SSC
溶液洗脱液进行洗脱，并用洗耳球迅速吹干玻片；在分裂相所在区域滴加8μ
L
的
DAPI
抗褪色剂进行复染，盖上盖玻片；最后用荧光显微镜观察分裂相，并进行拍照以及图片合成；
(4)
染色体清洗：用
75
％酒精将已经拍摄完的玻片中含有分裂相的部位的
DAPI
抗褪色剂洗掉，并用洗耳球吹干，以便后续进行
GISH
试验；
(5)
探针标记：提取目的
DNA
和封阻
DNA
；避光条件下采用德国的
Jena Bioscience
荧光探针
–
蛋白标记试剂盒对目的
DNA
进行标记得到目的基因组探针；
(6)GISH
鉴定：首先，将步骤
(4)
清洗后的片子依次洗涤或放紫外交联仪处理一遍，洗涤过程为：用2×
SSC
洗
5min
，
3:1
的无水乙醇
/
醋酸洗
10min
再继续利用2×

【专利技术属性】
技术研发人员：周梅，潘远智，雍雪，姜贝贝，贾茵，黄文沛，刘霄，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：