一种高纯度的外周血自体制造技术

一种高纯度的外周血自体

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基以及体外培养方法


[0001]本专利技术属于
NK
细胞培养
，涉及一种高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基以及体外培养方法
。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞
(NK)
，是一种
CD3
‑
CD56+
淋巴细胞，是非特异性免疫系统的重要组成部分，以
MHC(major histocompatibility complex
，主要组织相容性复合体
)
限制方式对恶性肿瘤和被病毒感染的细胞具有细胞毒作用，所以不识别靶细胞特异性的肿瘤抗原，但功能上类似于
T
淋巴细胞
。
精确调节
NK
细胞活化和抑制信号之间的平衡能介导细胞的溶解反应
。NK
细胞上的抑制信号是通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体
(KIRs)
主要通过与靶细胞上表达的
MHC I
类分子的相互作用
。
与此相反，
NK
细胞表面各种活化受体能介导激活信号，例如
NKG2D
，
NKp30
下
(CD337)
，
NKp44(CD336)
，和
NKP46。
所以，增强
NK
细胞活化受体表达或者减少肿瘤细胞
MHC
的表达能促进
NK
细胞介导的对肿瘤的杀伤作用
。
[0003]现在有许多细胞免疫疗法是从外周血单个核细胞
(PBMC)
中提取
NK
细胞，并将其在体外大量扩增后用于患者回输，但是不使用饲养细胞难以在体外扩增临床所需的大量
NK
细胞，这是因为把饲养细胞作为人工抗原呈递细胞，如辐照的外周血单核细胞
(PBMC)
，基因修饰的
K562
细胞和存在
Epstein
‑
Barr
病毒转化的类淋巴母细胞系
(EBV
‑
LCL)
，能够增强
NK
细胞的增殖能力
。
特别是，以
K562
为基础的人工抗原呈递细胞的表达
IL
‑
21
诱导以
PBMC
为起始细胞的
NK
细胞培养技术，培养
21
天可以获得增殖倍数的中位数为
30853。
然而，一些研究人员认为，用饲养细胞扩增的
NK
细胞这项技术是有问题的
。
例如，有人担心
NK
细胞的培养时间要长达
21
天，在输注后，由于已经脱离了饲养细胞对
NK
细胞提供培养的最佳环境，导致
NK
细胞的体内存活期缩短和细胞毒作用降低
。
为此，研究人员发展了纯因子的
NK
培养法，剔除了饲养细胞，但随之出现了
NK
细胞纯度低的缺点，这是由于
PBMC
中除了含有5～
10
％的
NK
细胞外，占据主要含量的是
T
细胞
、B
细胞，这些因子在刺激
NK
细胞增殖的同时，也在刺激
T
细胞
、
甚至
B
细胞增殖
。
[0004]为解决上述问题，本专利技术提出了一种抑制
T
细胞和
B
细胞增殖
、
刺激
NK
细胞增殖
、
提高
NK
细胞杀伤活性的培养方法，以解决
NK
细胞纯度低的问题
。
[0005]环孢霉素
A
是一种强效免疫抑制剂，其发挥作用的主要机制是环孢霉素
A
与亲环孢素形成复合物再与依赖钙
/
钙结合蛋白的钙调磷酸酶作用，抑制
NF
‑
AT
的去磷酸化使其不能进入核内，从而抑制
IL
‑2的产生，导致
T
细胞
、B
细胞的生成受抑制
。NKp30(CD337)
和
NKp44(CD336)
是
NK
细胞上的活化受体，激活这两类受体可刺激
NK
细胞增殖
。
富马酸单甲酯通过
NK
细胞脱颗粒和
NKp46
和
CD107a
的表达上调来增强
NK
细胞对肿瘤细胞的裂解能力
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有外周血自体
NK
细胞培养的不足之处，提供一种高纯度外周血
NK
细胞培养基以及体外培养方法，可以提高外周血自体
NK
细胞纯度，增强
NK
细胞杀
伤活性
。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基
(
包括但不限于
Corning581
培养基等
)
，所述添加物包括：环孢霉素
A、CD337
抗体
、CD336
抗体
、
富马酸单甲酯
、
自体血浆
、IL
‑
2、IL
‑
15、
及
IL
‑
21。
[0009]所述无血清免疫细胞培养基在所述
NK
细胞培养基中的体积百分数为
90
～
99
％
。
[0010]所述自体血浆在所述
NK
细胞培养基中的体积百分数为1～
10
％
。
[0011]优选地，其他各添加物在上述
NK
细胞培养基中的占比为：细胞培养基中的占比为：
[0012]本专利技术还提供了一种高纯度的外周血自体
NK
细胞体外扩增方法，包含以下技术步骤：
[0013](1)
应用淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞；
[0014](2)
将分离的单个核细胞加入到培养基
A
中培养3天，培养基
A
为添加有环孢霉素
A、CD336
抗体
、CD337
抗体...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基，所述添加物包括：环孢霉素
A、CD337
抗体
、CD336
抗体
、
富马酸单甲酯
、
自体血浆
、IL
‑
2、IL
‑
15、
及
IL
‑
21。2.
根据权利要求1所述的一种高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基，其特征在于，所述无血清免疫细胞培养基在所述高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基中的体积百分数为
90
‑
99
％
。3.
根据权利要求1或2所述的一种高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基，其特征在于，各添加物在所述高纯度的外周血自体
NK
细胞培养基中的占比为：
4.
一种高纯度的外周血自体
NK
细胞体外扩增方法，包包含以下技术步骤：
(1)
应用淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞；
(2)
将分离的单个核细胞加入到培养基
A
中培养3天，培养基
A
为添加有环孢霉素
A、CD336
抗体
、CD337
抗体
、IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21
及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(3)
培养第3天至第
11
天，每隔2天补充一次培养基
B
，培养基
B
为添加有
IL
‑
2、IL
‑
15
及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(4)
第
13
天，补充一次培养基
C
，培养基
C
为添加有富马酸单甲酯
、IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21
及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(5)
第
14
～
16
天收获细胞
。5.
根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体
NK
细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基
A
中含有
30ng/mL
环孢霉素
A、50ng/mLCD336
抗体
、50ng/mLCD337
抗体
、100ng/mL
的
IL
‑
2、50ng/mL
的
IL
‑
15、50ng/mL
的
IL
‑
21、10
％自体血浆及
90
％
v/v
的无血清免疫细胞培养基
。6.
根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体
NK
细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基
B
中含有
10...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧伟仲，戴国胜，阿卡尔，
申请(专利权)人：方舟启源北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：