一种重组载脂蛋白J、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种重组载脂蛋白J、制备方法及应用，所述重组载脂蛋白J包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述一级序列具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。本发明专利技术所述重组载脂蛋白J仅保留一对二硫键，使其分离纯化工艺简单可靠，可重复性强，终产率高；不带有标签，可以纯化达到国家规定的药用纯度，其体外活性与真核表达载脂蛋白J相当，在动物实验中针对多种适应症均表现出优异的疗效。疗效。疗效。

【技术实现步骤摘要】
一种重组载脂蛋白J、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种重组载脂蛋白J、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]载脂蛋白J(Clusterin)最早是从公羊的睾丸中分离的，因能促进Sertoli细胞的凝集，支持精子的成熟和发展，所以又被命名为凝集因子或丛集素，其在组织中广泛表达，是人体中发现的第一个分泌型大分子伴侣，与抑制细胞凋亡、灭活补体因子、脂质的回收和转运、细胞膜的保护以及维持细胞间或细胞与基质间的联系等多种生理和病理进程密切相关。
[0003]载脂蛋白J于1989年从人类血浆中首次分离得到，经mRNA指导前体多肽链合成后，酶解去除分泌信号肽并断裂形成α、β链，两条链反向平行由5个二硫键联接，经过糖基化修饰形成异二聚体硫酸化糖蛋白，包括449个氨基酸，包括糖基，其分子量约75
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80kDa；载脂蛋白J作为大分子伴侣，可通过自身的双亲基团与体内变性蛋白非共价结合，使变性蛋白保持溶解状态并经由正常代谢渠道降解清除，维持体内蛋白质代谢的动态平衡。同时可结合特定蛋白而具有抗炎和抑制免疫反应的功能，并可能与细胞受体结合而参与调节细胞凋亡和增殖。
[0004]由于其自身的多功能特性，载脂蛋白J参与体内多种病生理过程，对许多早中期疾病的发展有抑制作用，例如对多种早中期蛋白淀粉样变疾病、心血管疾病、眼部疾病等都有缓解和治疗作用，被国内外主流科学家认为是一种潜在的治疗性药物。
[0005]虽然载脂蛋白J在人体内广泛存在，但提取至药用级别的成本极高。即使不考虑纯度等指标能否合格，仅提取单个药用剂量就可能需要几千公升的人血，显然无法实现规模化生产，因而载脂蛋白J的重组、体外表达成为国内外科学界研究重点。为了确保其生物活性，现有的重组载脂蛋白J均保留原有的5对二硫键，如申请号202010644415.8、201580074616.6公开的多肽序列，在纯化时易发生错配和被还原而形成杂质，复性难度大且最终纯化收率极低；若利用蛋白标签进行分离纯化，最终得到的带有标签的重组蛋白难以符合药规要求而无法成药，这是实现其工业化生产的最大障碍之一。
[0006]因此，如果能够开发一种具备商业化大规模生产潜力的保留原有功能的重组载脂蛋白J作为临床治疗药物，那么将在多种疾病的临床治疗上提供重要的药物治疗手段，对现有的临床医学产生重大影响。

技术实现思路

[0007]本专利技术解决的问题是克服了现有重组载脂蛋白J的结构复杂性，在保持了重组载脂蛋白J生物学功能的前提下，使得重组载脂蛋白J的后续纯化操作简单化，并可实现重组载脂蛋白J的产业化。
[0008]为解决上述问题，本专利技术提供一种重组载脂蛋白J，包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。
[0009]优选的，所述一级序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:1一致。
[0010]优选的，两个所述半胱氨酸中的一个位于SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位氨基酸位点中的一个上，另一个位于SEQ ID NO:1的第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点中的一个上。
[0011]优选的，所述SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位、第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸或半胱氨酸。
[0012]优选的，所述氨基酸一级序列包括SEQ ID NO:4
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28。作为本专利技术的一个示例，所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上。或者所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第99位和第273位氨基酸位点上，或者所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第94位和第280位氨基酸位点上，或者所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第91位和第283位氨基酸位点上，所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第80位和第291位氨基酸位点上，优选的，所述SEQ ID NO:1第91位、第94位、第99位、第107位、263位、第273位、第280位、第283位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸，所述SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上为半胱氨酸。
[0013]优选的，所述重组载脂蛋白J还包括与SEQ ID NO:1的N端相连的信号肽序列，所述信号肽序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。优选的，所述信号肽序列为SEQ ID NO:2。
[0014]相对于现有技术，本专利技术所述重组载脂蛋白J具有下述有益效果：(1)所述重组载脂蛋白J仅保留一对二硫键使分离纯化工艺简单可靠，可重复性强，终产率高；不带有标签，可以纯化达到国家规定的药用纯度，其体外活性与真核表达载脂蛋白J相当，动物实验中针对多种适应症均表现出明显功能和疗效；(2)对于二硫键位置及信号肽序列进行研究，进一步改善其复性效果且表达量更高；(3)首次实现符合药规要求的的重组载脂蛋白J的工业化大批量生产。
[0015]本专利技术还提供了一种药物组合物，包含上述的重组载脂蛋白J，及其药学上可接受的辅料。优选的，所述组合物为水溶液或冻干粉。
[0016]本专利技术还提供了一种被分离的多聚核苷酸分子，包含编码如上所述的重组载脂蛋白J的核苷酸序列。优选的，所述编码载脂蛋白J的核苷酸序列可操作地连接在一个启动子上，所述启动子是在真核细胞或原核细胞内发挥功能的基因启动子。
[0017]本专利技术还提供了一种宿主细胞，其包含编码如上所述重组载脂蛋白J的多聚核苷酸分子。优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选的，所述原核细胞为细菌细胞，所述真核细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞或酵母细胞。
[0018]本专利技术还提供了一种制备重组载脂蛋白J的方法，包括：步骤1)、表达编码如上所述重组载脂蛋白J的多聚核苷酸分子；步骤2)、从表达细胞中提取、纯化所表达的多肽。
[0019]优选的，步骤2)包括：S21菌体破碎并分离包涵体；S22、包涵体洗涤、溶解；S23、离子交换层析；S23、稀释复性；S24、超滤浓缩并换液或硫酸铵沉淀并换热；S25、分子筛层析。
[0020]本专利技术还提供了上述的重组载脂蛋白J在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。进一步的，所述疾病包括心血管疾病、蛋白淀粉样变性疾病、眼表疾病。
[0021]所述疾病还包括阿尔茨海默症、酒精中毒、男性不育等。其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化症、缺血性心脏病、冠心病、心脑梗、高血脂症、高胆固醇症、高血压、高血糖、慢性心力衰竭、缺血性心力衰竭、冠心病性心力衰竭、血管内斑块沉积等。所述蛋白淀粉样
变性疾病，包括轻链(AL)、重链(AA)、血清淀粉样蛋白(SAA/AA)、甲状腺素转运蛋白(TTR)的原发和继发性蛋白淀粉样变性疾病、干眼症等眼部疾病。
[0022]更进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载脂蛋白J(Clusterin)，包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，其特征在于，所述氨基酸一级序列具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。2.根据权利要求1所述的重组载脂蛋白J，其特征在于，所述一级序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:1一致。3.根据权利要求2所述的重组载脂蛋白J，其特征在于，两个所述半胱氨酸中的一个位于SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位氨基酸位点中的一个上，另一个位于SEQ ID NO:1的第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点中的一个上。4.根据权利要求3所述的重组载脂蛋白J，其特征在于，所述SEQ ID NO:1第80位、第91位、第94位、第99位、第107位、263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸或半胱氨酸。5.根据权利要求4所述的重组载脂蛋白J，其特征在于，所述一级序列为SEQID NO:4
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28。6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1
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5中任一项所述的重组载脂蛋白J，及其药学上可接受的辅料。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翔，耿永健，杜佩云，
申请(专利权)人：厦门德馨尚品医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：