太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物及检测方法，包括以下序列的引物：内引物

【技术实现步骤摘要】
太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及一种太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物及检测方法，应用在太子参上的蚕豆萎蔫病毒检测领域
。

技术介绍

[0002]蚕豆萎蔫病毒
(broad bean wilt virus
，
BBWV)
是豇豆花叶病毒科蚕豆病毒属的成员
。
病毒粒子球状，直径约
30nm。
该病毒寄主范围广，可侵染豆科
、
茄科
、
藜科
、
十字花科等
20
多种植物
。
汁液稀释限点
10000
‑
100000
倍，钝化温度
58℃
，体外存活期温度
21℃2
‑3天
。
太子参的病毒病危害严重，福建省柘荣县盛产太子参，该地区的太子参发病率可达
90
％以上，造成太子参减产严重
。
目前已知的太子参侵染病毒一共有4种，蚕豆萎蔫病毒是其中之一
。
研究开发蚕豆萎蔫病毒的检测技术能够为病毒的早期防控和脱毒种苗制备提供技术保障
。
[0003]目前植物病毒的检测技术主要有电镜观察法
、
生物接种法
、
血清学法和
PCR
法
。
电镜观察法对人员和仪器设备要求高，操作复杂，耗时长
。
生物接种法灵敏度低，耗时长
。
血清学法对仪器设备要求较高，灵敏度较低，耗时较长
。
而
PCR
法对仪器设备要求较高
。
[0004]环介导等温扩增技术，英文名称为
loop
‑
mediated isothermal amplification
，能在等温
(60
‑
65℃)
条件下，短时间
(
通常是一小时内
)
内进行核酸扩增，是一种“简便
、
快速
、
精确
、
低价”的基因扩增方法
。
与常规
PCR
相比，其不需要模板的热变性
、
温度循环
、
电泳及紫外观察等过程
。
该技术在灵敏度
、
特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于
PCR
技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量
PCR
，是一种全新的核酸扩增方法
。
然而现有市面上没有能够适用于环介导等温扩增检测太子参中的蚕豆萎蔫病毒的引物
。
[0005]因此提供一种能够利用于环介导等温扩增技术对太子参中的蚕豆萎蔫病毒进行快速
、
有效检测的太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物及检测方法己成为当务之亟
。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术没有合适的引物能够用于环介导等温扩增技术以对太子参中的蚕豆萎蔫病毒进行快速
、
有效检测的缺点，本专利技术提供一种太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物及检测方法，通过针对太子参蚕豆萎蔫病毒设计的环介导等温扩增引物，实现能够利用环介导等温扩增技术对太子参蚕豆萎蔫病毒进行快速
、
有效的检测
。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物，包括以下序列的引物：
[0009]内引物
FIP:
[0010]CGAAACATAAACGCTGGGGCGCAATTTTTTTACTACGAACCTGC
[0011]内引物
BIP:
[0012]CTCTGGCTTTCAAGCAAGGGTCCTTTCCATCAGTTTGAGG
[0013]外引物
F3:
[0014]AGGTTGATGCTAGAATTAGCT
[0015]外引物
B3:
[0016]GGCAAAAGTTGAAGTCACC
[0017]环引物
LF:
[0018]GGTTGCAATTTGTTTGGGTAACACA
[0019]环引物
LB:
[0020]GAGCGCATGGCCTATGC。
[0021]本案为特别设计的三对引物使得利用环介导等温扩增法检测太子参中的蚕豆萎蔫病毒成为可能，其不仅快速
、
有效，而且对仪器设备要求较低
、
灵敏度高，能节约大量人力物力
。
[0022]上述三对引物的设计过程如下：
[0023](
一
)
太子参中蚕豆萎蔫病毒的总
RNA
提取
[0024]取太子参新鲜病叶
100mg
，加入液氮研磨至粉末状，采用植物总
RNA
试剂盒方法提取太子参总
RNA
，并于
‑
80℃
保存备用
。
[0025](
二
)cDNA
的反转录合成
[0026]采用步骤
(
一
)
获得太子参总
RNA
和反转录试剂盒，合成太子参
cDNA
，
‑
20℃
保存
。
[0027](
三
)
环介导等温扩增引物组设计
[0028]检索
NCBI
网站，获得蚕豆萎蔫病毒
BBWV
的
CP
基因保守序列，应用
PrimerExplorer V5
在线软件，设计多组环介导等温扩增扩增引物
。
[0029](
四
)
环介导等温扩增
[0030]利用设计好的各组引物对步骤
(
三
)
获得的太子参
cDNA
进行环介导等温扩增，扩增反应体系如下：
[0031]10
×
BST buffer 2.5
μ
L
[0032]cDNA 1
μ
L
[0033]引物
FIP 2
μ
L
[0034]引物
BIP 2
μ
L
[0035]引物
F31
μ
L
[0036]引物
B31
μ
L
[0037]引物
LF 1
μ
L
[0038]引物
LB 1
μ
L
[0039]BST
酶1μ
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物，其特征在于：包括以下序列的引物：内引物
FIP:CGAAACATAAACGCTGGGGCGCAATTTTTTTACTACGAACCTGC
内引物
BIP:CTCTGGCTTTCAAGCAAGGGTCCTTTCCATCAGTTTGAGG
外引物
F3:AGGTTGATGCTAGAATTAGCT
外引物
B3:GGCAAAAGTTGAAGTCACC
环引物
LF:GGTTGCAATTTGTTTGGGTAACACA
环引物
LB:GAGCGCATGGCCTATGC。2.
一种应用权利要求1所述的太子参蚕豆萎蔫病毒检测引物检测太子参蚕豆萎蔫病毒的检测方法，其特征在于：包括以下依序进行的步骤：
(1)
太子参总
RNA
提取：取待测太子参待测样新鲜病叶
80
‑
120mg
，加入液氮并研磨至粉末状，采用植物总
RNA
试剂盒方法提取太子参总
RNA
；
(2)cDNA
的反转录合成：采用反转录试剂盒，将步骤
(1)
提取的太子参总
RNA
反转录为
cDNA
；
(3)
采用环介导等温扩增技术对步骤
(2)
获得的
cDNA
进行扩增：其中，扩增反应体系如下：
10
×
BST buffer 2
‑3μ
LcDNA 0.5
‑
1.5
μ
L
引物
FIP 1
‑
3.5
μ
L
引物
BIP 1
‑
3.5
μ
L
引物
F30.5
‑
1.5
μ
L
引物
B30.5
‑
1.5
μ
L
引物
LF 0.5
‑
1.5
μ
L
引物
LB 0.5
‑
1.5
μ
LBST
酶
0.5
‑
1.5
μ
LMg
2+
0.25
‑1μ
LdNTP 1.5
‑5μ
L5M
甜菜碱1‑7μ
LddH2O
加满至
25
μ
L
；反应程序如下：扩增：
62
‑
66℃
，
40
‑
90min
；热激：
78
‑
82℃
，4‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄颖桢，陈菁瑛，赵云青，刘保财，张武君，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：