用于鉴定松材线虫的检测试剂制造技术

本发明专利技术涉及一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定松材线虫的检测试剂、试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及生物学检测
，特别是涉及一种用于鉴定松材线虫的检测试剂
、
试剂盒和应用
。

技术介绍

[0002]松材线虫病是一种毁灭性的森林灾害，于
20
世纪
80
年代初传入我国境内，随后迅速扩散蔓延
。
截止
2023
年，松材线虫病已在全国
701
个县级疫区被发现，对我国的松林生态系统构成了严重的破坏和威胁
。
[0003]松材线虫
(Bursaphelenchusxylophilus)
的鉴定主要依靠成虫的形态特征，但是通过形态学准确鉴定松材线虫成虫对于非专业人员相当困难，且无法对幼虫进行准确鉴定
。
由于形态学的限制，免疫学
、
生理生化和分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上
。
目前，市面上松材线虫的检测与鉴定主要以
DNA
探针技术的
PCR
扩增技术为主，虽能有效地鉴定松材线虫，但费用较高，但是检测设备巨大
、
沉重
、
不易携带，且检测设备和检测试剂费用昂贵，不利于松材线虫的快速检测
。

技术实现思路

[0004]针对上述技术问题，本专利技术提供一种高灵敏性
、
高特异性
、
快速
、
可视化的鉴定松材线虫的检测试剂及试剂盒
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术第一个目的是提供一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的
Bx
‑
12
基因的特异性引物对
。
[0007]优选地，所述引物对包括：
[0008]Bx
‑
12
基因上游引物：序列如
SEQ ID NO:2
所示；
[0009]Bx
‑
12
基因下游引物：序列如
SEQ ID NO:3
所示
。
[0010]优选地，所述
Bx
‑
12
基因下游引物的5’
端用生物素修饰
。
[0011]优选地，所述检测试剂还包括：针对松材线虫的
Bx
‑
12
基因的特异性检测探针；
[0012]优选地，所述检测探针的序列如
SEQ ID NO:4
所示；
[0013]优选地，所述检测探针的5’
端用
FAM
标记；
[0014]优选地，所述检测探针的3’
端用
C3 spacer
标记；
[0015]优选地，从所述检测探针5’
端开始计算，第
35
个碱基
‘
T
’
用
‑
THF
‑
替代
。
[0016]本专利技术第二个目的是提供一种用于检测松材线虫的冻干微球，所述冻干微球包括用于扩增松材线虫的
Bx
‑
12
基因的特异性引物对
。
[0017]优选地，所述引物对包括：
[0018]Bx
‑
12
基因上游引物：序列如
SEQ ID NO:2
所示；
[0019]Bx
‑
12
基因下游引物：序列如
SEQ ID NO:3
所示；
[0020]优选地，所述
Bx
‑
12
基因下游引物的5’
端用生物素修饰；
[0021]进一步优选地，所述冻干微球还包括特异性检测探针，序列如
SEQ ID NO:4
所示；
[0022]更进一步优选地，所述检测探针的5’
端用
FAM
标记；
[0023]更进一步优选地，所述检测探针的3’
端用
C3 spacer
标记；
[0024]更进一步优选地，从所述检测探针5’
端开始计算，第
35
个碱基
‘
T
’
用
‑
THF
‑
替代
。
[0025]本专利技术第三个目的是提供一种检测松材线虫的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的检测试剂或如上述所述的冻干微球
。
[0026]优选地，所述
Bx
‑
12
基因上游引物的浓度为8～
15
μ
M
，优选为8～
12
μ
M
，更优选为，9～
11
μ
M
，最优选为
10
μ
M
；
[0027]优选地，所述
Bx
‑
12
基因下游引物的浓度为8～
15
μ
M
，优选为8～
12
μ
M
，更优选为，9～
11
μ
M
，最优选为
10
μ
M
；
[0028]优选地，检测探针的浓度为8～
15
μ
M
，优选为8～
12
μ
M
，更优选为，9～
11
μ
M
，最优选为
10
μ
M。
[0029]本专利技术第四个目的是提供一种利用上述任一项所述检测试剂或上述所述的冻干微球鉴别松材线虫的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0030](1)
制备松材线虫
DNA
；
[0031](2)
将松材线虫
DNA、
所述引物对
、
特异性检测探针加入反应体系中并对所述反应体系进行扩增；或
[0032]将松材线虫
DNA
加入冻干微球中，进行扩增；
[0033](3)
利用试纸条夹心检测技术对扩增产物进行检测
。
[0034]优选地，控制所述扩增的温度为
25
～
40℃
，优选为
30
～
40℃
，更优选为
35
～
40℃
；
[0035]优选地，控制所述扩增的时间为5～
15min
，优选为8～
15min
，更优选为
10
～
15mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的
Bx
‑
12
基因的特异性引物对
。2.
根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述引物对包括：
Bx
‑
12
基因上游引物：序列如
SEQ ID NO:2
所示；
Bx
‑
12
基因下游引物：序列如
SEQ ID NO:3
所示；优选地，所述
Bx
‑
12
基因下游引物的5’
端用生物素修饰
。3.
根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括：针对松材线虫的
Bx
‑
12
基因的特异性检测探针；优选地，所述检测探针的序列如
SEQ ID NO:4
所示；优选地，所述检测探针的5’
端用
FAM
标记；优选地，所述检测探针的3’
端用
C3 spacer
标记；优选地，从所述检测探针5’
端开始计算，第
35
个碱基
‘
T
’
用
‑
THF
‑
替代
。4.
一种用于检测松材线虫的冻干微球，其特征在于，所述冻干微球包括用于扩增松材线虫的
Bx
‑
12
基因的特异性引物对
。5.
根据权利要求4所述的冻干微球，其特征在于，所述引物对包括：
Bx
‑
12
基因上游引物：序列如
SEQ ID NO:2
所示；
Bx
‑
12
基因下游引物：序列如
SEQ ID NO:3
所示；优选地，所述
Bx
‑
12
基因下游引物的5’
端用生物素修饰；优选地，所述冻干微球还包括特异性检测探针，序列如
SEQ ID NO:4
所示；优选地，所述检测探针的5’
端用
FAM
标记；优选地，所述检测探针的3’
端用
C3 spacer
标记；优选地，从所述检测探针5’
端开始计算，第
35
个碱基
‘
T
’
用
‑
THF
‑
替代
。6.
...

【专利技术属性】
技术研发人员：理永霞，张伟，王鹏，温晓健，李东振，王璇，刘振凯，冯宇倩，张星耀，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所国家林业和草原局世界自然遗产保护研究中心，
类型：发明
国别省市：