一种银耳孢子原生质体的制备与再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效获得银耳孢子原生质体制备和再生的方法，该方法包括银耳孢子活化培养

【技术实现步骤摘要】
一种银耳孢子原生质体的制备与再生的方法


[0001]本专利技术属于真菌原生质体制备及再生
，具体涉及一种银耳孢子原生质体的制备与再生的方法
。

技术介绍

[0002]银耳
(Tremella fuciformis)
属于担子菌门
、
银耳目
、
银耳科真菌，作为我国传统的药食同源真菌，其富含多糖
、
蛋白质
、
氨基酸等多种活性成分，具有较高的营养及医用价值
。
银耳多糖作为银耳的主要活性成分，研究表明其具有抗氧化
、
调节免疫力
、
降血糖血脂
、
抗肿瘤等生理活性
。
银耳孢子的深层发酵及基于原生质体的遗传育种是目前研究的热门领域，然而其分子生物学手段的研究尚处于起步阶段
。
[0003]高效制备原生质体技术是建立食用菌分子遗传体系的重要基础
。
原生质体的制备与再生在遗传转化
、
细胞融合
、
性状改良
、
基因重组等领域发挥重要作用
。
制备原生质体时，由于银耳孢子细胞壁的成分极为复杂且厚度较大，以单一种类的酶作用于细胞壁时，酶解效果往往较差，所需酶解时间长，获得的原生质体活力低，原生质体形成率和复生率偏低
。
将多种功能性降解酶进行复配使用，有利于提高银耳孢子细胞壁的酶解效率，缩短原生质体的制备时间，提高银耳孢子原生质体的再生率
。
因此，本专利技术力求开发一种易操作
、
用时短
、
效率高的银耳孢子原生质体制备的方法，为将来银耳分子水平的理论研究提供技术支撑
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中银耳孢子自身细胞壁较厚，制备银耳孢子原生质体的方法效率低下，并且原生质体再生率不高的情况，提供一种银耳孢子原生质体的制备与再生的方法
。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术针对银耳孢子细胞壁多糖的糖苷键构成，采用复合酶系处理银耳孢子，然后从酶解液中分离得到原生质体，最后通过优化再生培养条件，显著提高制备率和复生率
。
具体采用的技术方案如下：
[0006]一种银耳孢子原生质体的制备与再生的方法，包括如下步骤：
[0007](1)
银耳孢子活化培养：挑取银耳孢子菌落在
PDA
固体培养基上活化培养，得到活化后的银耳孢子；
[0008](2)
银耳孢子种子液培养：将步骤
(1)
活化后的银耳孢子接种于种子液培养基中进行发酵培养，得到银耳孢子悬液，将银耳孢子悬液离心后获得沉淀，即为银耳孢子菌体；
[0009](3)
银耳孢子原生质体酶解液制备：将步骤
(2)
得到的银耳孢子菌体用稳渗剂洗涤
、
离心去上清后，重悬于复合酶解液中进行酶解，制备得到银耳孢子原生质体酶解液；
[0010](4)
银耳孢子原生质体再生：将步骤
(3)
获得的银耳孢子原生质体酶解液离心去上清分离出原生质体，用稳渗剂洗涤并稀释制成原生质体悬浮液，将原生质体悬浮液涂布于再生培养基上培养形成再生菌落；
[0011]其中，所述的银耳孢子包括但不限于银耳子实体散落的银耳孢子
、
菌种保藏机构及公司盈利机构所持有的银耳孢子
、
实验室使用的银耳孢子
、
经分子生物学手段得到的银耳孢子转化子等，现有技术中属于银耳孢子范畴的菌体均适用于本专利技术
。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述的银耳孢子为酵母状银耳孢子，该菌株于
2021
年3月
21
日分离自福建古田的银耳子实体，已于
2022
年
01
月
14
日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株号：
S
‑
41
，分类命名：银耳
Tremella fuciformis
，保藏编号
:CGMCC No.40060
，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
。
[0013]其中，步骤
(1)
中，所述的活化培养，其培养条件为：
24
～
30℃
，培养5～8天
。
[0014]其中，步骤
(2)
中，所述的发酵培养，其培养条件为：
20
～
32℃
，
150
～
200rpm
，培养3～5天
。
[0015]其中，步骤
(2)
中，所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖5～
30g/L
，酵母粉1～
5g/L
，蛋白胨1～
5g/L
，硫酸镁
0.1
～
2g/L
，磷酸二氢钾1～
10g/L
，磷酸氢二钾
0.1
～
2g/L
，溶剂为水
。
[0016]其中，步骤
(3)
或步骤
(4)
中，所述的稳渗剂为以
0.5
～
1.0mol/L
磷酸钠缓冲液为溶剂配制的
0.4
～
1.2mol/L
氯化钾溶液，
pH
＝5～
8。
[0017]优选的，所述的稳渗剂为以
1mol/L
磷酸钠缓冲液为溶剂配制的
0.4
～
1.2mol/L
氯化钾溶液，
pH
＝5～
8。
[0018]具体的，所述的
1mol/L
磷酸钠缓冲液，其配方为：称取
136.1g
磷酸二氢钠和
176.2g
磷酸氢二钠分别溶解于超纯水中，定容至
1L。
按照下述比例混合
1mol/L
磷酸二氢钠与
1mol/L
磷酸氢二钠，配置得到
pH
为
5(1.0:99.0)、6(12.0:88.0)、7(57.7:42.3)、8(93.2:6.8)
的
1mol/L
磷酸钠缓冲液，备用
。
[0019]其中，步骤
(3)
中，所述的重悬，其重悬后的银耳孢子的菌体浓度为
108～
10
10
个孢子
/mL。
[0020]其中，步骤
(3)
中，所述的复合酶解液包括溶壁酶
、
崩溃酶和稳渗剂，其制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种银耳孢子原生质体的制备与再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
银耳孢子活化培养：挑取银耳孢子菌落在
PDA
固体培养基上活化培养，得到活化后的银耳孢子；
(2)
银耳孢子种子液培养：将步骤
(1)
活化后的银耳孢子接种于种子液培养基中进行发酵培养，得到银耳孢子悬液，将银耳孢子悬液离心后获得沉淀，即为银耳孢子菌体；
(3)
银耳孢子原生质体酶解液制备：将步骤
(2)
得到的银耳孢子菌体用稳渗剂洗涤
、
离心去上清后，重悬于复合酶解液中进行酶解，制备得到银耳孢子原生质体酶解液；
(4)
银耳孢子原生质体再生：将步骤
(3)
获得的银耳孢子原生质体酶解液离心去上清分离出原生质体，用稳渗剂洗涤并稀释制成原生质体悬浮液，将原生质体悬浮液涂布于再生培养基上培养形成再生菌落；其中，步骤
(3)
中，所述的复合酶解液包括溶壁酶
、
崩溃酶和稳渗剂
。
其中，步骤
(4)
中，所述的再生培养基中包括再生稳渗剂和促进剂
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
中，所述的活化培养，其培养条件为：
24
～
30℃
，培养5～8天
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(2)
中，所述的发酵培养，其培养条件为：
20
～
32℃
，
150
～
200rpm
，培养3～5天；所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖5～
30g/L
，酵母粉1～
5g/L
，蛋白胨1～
5g/L
，硫酸镁
0.1
～
2g/L
，磷酸二氢钾1～
10g/L
，磷酸氢二钾
0.1
～
2g/L
，余下为水
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(3)
或步骤
(4)
中，所述的稳渗剂为以
0.5
～
1.0mol/L
磷酸钠缓冲液为溶剂配制的
0.4
～
1.2mol/L
氯化钾溶液，
pH
＝5～
8。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(3)
中，所述的重悬，其重悬后的银耳孢子的菌体浓度为

【专利技术属性】
技术研发人员：李莎，余才元，张琦，徐虹，雷鹏，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：