基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法，包括一

【技术实现步骤摘要】
基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法


[0001]本专利技术涉及检测分析
，特别涉及一种基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法
。

技术介绍

[0002]目前，常用的毒品快速检测方法是毒品胶体金免疫层析检测法，用到的识别分子为能与毒品抗原特异性结合的单克隆抗体
。
该方法价格低廉
、
快速便捷，通过肉眼观察颜色变化就能对毒品进行定性分析，广泛应用在公安缉毒侦查和戒毒人员监控领域
。
[0003][0004]核酸适配体
(Aptamer)
是从人工构建的随机单链序列中筛选出的能与蛋白质
、
核酸
、
小分子物质等各种配体特异性结合的寡核苷酸片段，一般由
20
‑
80
个碱基组成
。1990
年，
Tuerk
和
Gold
运用体外筛选与
PCR
扩增相结合的技术，从含有8个随机序列的
RNA
文库中筛选到了能特异性结合噬菌体
T4 DNA
聚合酶的
RNA
序列，并将该技术定义为配体指数富集系统进化技术
(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
，
SELEX)。
同年，
Ellington
和
Szoatak
运用该技术筛选到针对有机小分子染料的
RNA
寡核苷酸，将其命名为“Aptamer”。
核酸适配体的出现使得筛选针对各种靶分子的高亲和力和特异性的识别体成为可能，作为抗体的互补或替代试剂，对快速检测技术的发展起到重要的推动作用
。
[0005]经典的
SELEX
方法通常基于硝酸纤维素膜
(
主要针对蛋白等大分子靶标
)、
微孔板
、
亲和凝胶柱
、
磁性微球等分离方法
。
这些方法往往筛选轮数多
(>10
轮
)
，且需要耗费大量人力，即使为了提高筛选效率，之后又发展出了
CE
‑
SELEX、Microfluidic
‑
SELEX、Flow cytometry
‑
SELEX
等新的
SELEX
方法
。
但这些方法只能在筛选结束后运用其它分析手段
(
如光谱法
、
凝胶阻滞分析法
、
表面等离子体共振法
)
对每轮筛选获得的次级库和靶分子的结合特性进行检测
。
一方面无法在筛选过程中实时掌握序列进化过程，进行有效地策略调整；另一方面也无法快速判断富集是否达到饱和，从而及时结束筛选循环
。
上述方法筛选效率低
、
无法在筛选过程中进行实时评价的缺陷成为了高效获得适配体的障碍，尤其是针对数量巨大的新精神活性物质靶标，这一缺陷更为突出
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法，具有快速
、
无需标记
、
能实时监测筛选性能的优势，大大提升获取高性能适配体的效率
。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法，包括以下步骤：一
、
靶分子的化学修饰
通过化学合成使芬太尼类分子带有末端修饰氨基或生物素的烷基链或聚乙二醇链，采用核磁共振波谱法
、
红外光谱法和高分辨质谱法对修饰后的靶分子进行结构确认，采用高效液相色谱法对纯度进行分析；二
、
适配体筛选芯片的构建采用葡聚糖基质芯片偶联修饰氨基的靶分子来构建适配体筛选芯片，偶联过程包括活化
、
偶联和封闭三个步骤；或采用链霉亲和素修饰的葡聚糖基质芯片偶联修饰生物素的靶分子来构建适配体筛选芯片，偶联过程包括活化和偶联两个步骤；或采用葡聚糖基质芯片用于偶联芬太尼完全抗原来构建适配体筛选芯片，偶联过程包括活化
、
偶联和封闭三个步骤
。
[0008]三
、SPR
‑
SELEX
筛选适配体方法的建立
3.1
引物和库的设计与体外合成设计并人工合成
ssDNA
文库和引物；
3.2SPR
‑
SELEX
筛选
ssDNA
文库溶解稀释后作为初始文库；进样前，对初始文库进行预处理，将预处理好的文库注入
SPR
分子间相互作用仪；文库流过筛选芯片表面时，串联流过样品通道
Fc1
～
Fc4
与上面偶联的靶分子相互作用；之后将洗涤缓冲液注入系统，将与靶分子不结合或结合弱的序列解离冲洗掉；剩下的仍与靶分子结合的序列用再生试剂进行洗脱，并通过软件设定回收程序收集洗脱下来的全部馏分；同时，将文库流过空白芯片，经过相同的结合
、
洗涤
、
洗脱和回收步骤作为阴性对照；
3.3PCR
扩增及次级文库的生成将每一轮筛选回收的核酸作为模板进行
PCR
扩增，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，切胶纯化
PCR
产物，采用微量分光光度计测纯化产物的
OD
值；室温下，将纯化产物与标有链霉亲和素的磁珠孵育，利用生物素与链霉亲和素的特异识别作用，使目标
DNA
与磁珠结合，置于磁力架后弃上清，用缓冲液洗涤多次，加入
NaOH
溶液孵育使
dsDNA
碱变性解链，置于磁力架分离后吸取上清用
HCl
中和；采用微量分光光度计或荧光计测其
OD
值，作为次级文库投入下一轮筛选；四
、
高通量测序随着轮数增加，与靶分子特异性结合的
ssDNA
序列不断富集，筛选的轮数在5‑
10
轮，将最后一轮筛选回收的核酸用未标记生物素的引物进行
PCR
扩增，对切胶纯化后的
PCR
产物进行定量；然后进行文库制备；对文库做质控
、
定量
、
均一化混合后，在
Illumina
测序平台上进行高通量测序；对数据进行生信质控和分析，从而获得候选序列
。
[0009]五
、
通过结合活性表征从候选序列中筛选确定阳性序列
。
[0010]步骤...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于表面等离子体共振技术筛选芬太尼类物质核酸适配体的方法，其特征在于，包括以下步骤：一
、
靶分子的化学修饰通过化学合成使芬太尼类分子带有末端修饰氨基或生物素的烷基链或聚乙二醇链，采用核磁共振波谱法
、
红外光谱法和高分辨质谱法对修饰后的靶分子进行结构确认，采用高效液相色谱法对纯度进行分析；二
、
适配体筛选芯片的构建采用葡聚糖基质芯片偶联修饰氨基的靶分子来构建适配体筛选芯片，偶联过程包括活化
、
偶联和封闭三个步骤；或采用链霉亲和素修饰的葡聚糖基质芯片偶联修饰生物素的靶分子来构建适配体筛选芯片，偶联过程包括活化和偶联两个步骤；或采用葡聚糖基质芯片用于偶联芬太尼完全抗原来构建适配体筛选芯片，偶联过程包括活化
、
偶联和封闭三个步骤；三
、SPR
‑
SELEX
筛选适配体方法的建立
3.1
引物和库的设计与体外合成设计并人工合成
ssDNA
文库和引物；
3.2SPR
‑
SELEX
筛选
ssDNA
文库溶解稀释后作为初始文库；进样前，对初始文库进行预处理，将预处理好的文库注入
SPR
分子间相互作用仪；文库流过筛选芯片表面时，串联流过样品通道
Fc1
～
Fc4
与上面偶联的靶分子相互作用；之后将洗涤缓冲液注入系统，将与靶分子不结合或结合弱的序列解离冲洗掉；剩下的仍与靶分子结合的序列用再生试剂进行洗脱，并收集洗脱下来的全部馏分；同时，将文库流过空白芯片，经过相同的结合
、
洗涤
、
洗脱和回收步骤作为阴性对照；
3.3PCR
扩增及次级文库的生成将每一轮筛选回收的核酸作为模板进行
PCR
扩增，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，切胶纯化
PCR
产物，采用微量分光光度计测纯化产物的
OD
值；室温下，将纯化产物与标有链霉亲和素的磁珠孵育，利用生物素与链霉亲和素的特异识别作用，使目标
DNA
与磁珠结合，置于磁力架后弃上清，用缓冲液洗涤多次，加入
NaOH
溶液孵育使
dsDNA
碱变性解链，置于磁力架分离后吸取上清用
HCl
中和；采用微量分光光度计或荧光计测其
OD
值，作为次级文库投入下一轮筛选；四
、
高通量测序随着轮数增加，与靶分子特异性结合的
ssDNA
序列不断富集，将最后一轮筛选回收的核酸用未标记生物素的引物进行
PCR
扩增，对切胶纯化后的
PCR
产物进行定量；然后进行文库制备；对文库做质控
、
定量
、
均一化混合后，在<...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹芳琦，刘文斌，江雪，赵雪珺，陈红，何杉，袁晓亮，徐见容，陈锡祥，
申请(专利权)人：上海市刑事科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：