一种“肠-脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种“肠

【技术实现步骤摘要】
一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种动物模型的构建方法，尤其是一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]模型小鼠是研究疾病发病机制
、
治疗策略必不可少的工具，目前建立模型小鼠的常用方法是
CRISPR
‑
Cas9
技术
。
[0003]Tau
蛋白是阿尔茨海默病
(AD)
中重要的病理蛋白，由
MAPT
基因编码，可以聚集形成神经纤维缠结
。Tau
蛋白的聚集与认知功能的损害成高度相关关系，近年来有研究发现，
AD
病人肠道中存在
Tau
蛋白聚集，并有研究发现肠道注射病人来源的
Tau
蛋白可诱导脑内出现神经纤维缠结，提示阿尔茨海默病可能通过肠道途径传播至脑内
。
然而目前缺乏可靠的研究
Tau
蛋白“肠
‑
脑轴”致阿尔茨海默病变的小鼠模型，对研究外周系统特别是肠道系统对中枢认知功能的影响造成了障碍
。

技术实现思路

[0004]为了填补现有模型的不足，本专利技术的目的在于提供一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法和应用，以更好地研究
Tau
蛋白“肠
‑
脑轴”致阿尔茨海默病变
。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术公开了一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
[0007]1)
通过将
MAPT、P2A、RFP、Sox10MCS4、CFOS
和
rtTA3G
连接在
pTRE3G
表达载体上，得到
donor
载体；
[0008]2)
将
Cas9
蛋白
、
步骤
1)
得到的
donor
载体和
gRNA
显微注射到供体小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到受体小鼠中备孕，繁殖子代；
[0009]3)
让基因组中带有外源性
MAPT
基因的子代小鼠与野生型小鼠交配，对交配得到的子代小鼠采用四环素灌胃，直到小鼠出现阿尔茨海默样病理改变，认为得到“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型
。
[0010]优选地，步骤
1)
中，将
MAPT、P2A、RFP
及
polyA
尾连接到
pTRE3G
载体上，得到
pTRE3G
‑
MAPT
‑
P2A
‑
RFP
；将
CFOS
与
Sox10MCS4
融合后连接到
rtTA3G
‑
polyA
上，得到
Sox10MCS4
‑
CFOS
‑
rtTA3G
；再将得到的
Sox10MCS4
‑
CFOS
‑
rtTA3G
连接到
pTRE3G
‑
MAPT
‑
P2A
‑
RFP
上，得到
donor
载体
。
[0011]优选地，步骤
2)
中，
gRNA
的序列如
SEQ ID NO.15
所示
。
[0012]优选地，步骤
2)
中，
Cas9
蛋白
、donor
载体和
gRNA
的体积比为
1:8:2。
[0013]优选地，步骤
2)
中，供体小鼠为
C57BL/6JGpt
雌鼠
。
[0014]优选地，步骤
2)
中，受体小鼠为
ICR
雌鼠
。
[0015]优选地，步骤
3)
中，所述四环素为
10mg/mL
的盐酸四环素
。
[0016]优选地，步骤
3)
中，交配得到的子代小鼠为2月龄
。
[0017]优选地，步骤
3)
中，对交配得到的子代小鼠采用四环素灌胃，直到小鼠出现阿尔茨海默样病理改变并逐渐加重，认为得到“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型
。
[0018]优选地，所述“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型能够出现肠道功能障碍
、
运动功能障碍
、
认知障碍和肠道及脑内病理蛋白沉积的症状
。
[0019]本专利技术还公开了上述“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法得到的小鼠模型在探索肠道源性阿尔茨海默病的发病机制及神经环路中的应用
。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术提供的一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法，首先，以
donor
载体作为目的基因载体，采用
CRISPR/Cas9
技术将含有四环素诱导表达系统的基因片段插入小鼠的
H11
位点，基因片段中的启动子序列为
CFOS
启动序列，联合
Sox10MCS4
增强子序列，可保证插入的基因片段的表达局限在肠道神经系统中，使构建的系统能够实现在空间上的诱导表达
。
以“Tet
‑
on”系统为突破点，所转基因片段含有四环素诱导表达系统，通过四环素开启构建的系统在时间上的诱导表达，在上述组织内，
rtTA3G
在特异启动子驱动下表达，此时
rtTA3G
的构象不能结合到
pTRE3G
启动子上；当加入四环素后，改变
rtTA3G
的构象，使其结合到
pTRE3G
启动子上，启动
MAPT
的表达，从而实现时间和空间上的诱导表达
。
其次，整个构建过程中采用盐酸四环素灌胃，几乎不通过血脑屏障的原理来诱导肠道内致病蛋白的表达，小鼠模型的行为学表型与典型阿尔茨海默病的动物行为类似，属于从全新的角度去研究阿尔茨海默的传递机制
。
最后，由于该动物模型构建来源于基因修饰小鼠的交配，可以得到大量模型小鼠，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)
通过将
MAPT、P2A、RFP、Sox10MCS4、CFOS
和
rtTA3G
连接在
pTRE3G
表达载体上，得到
donor
载体；
2)
将
Cas9
蛋白
、
步骤
1)
得到的
donor
载体和
gRNA
显微注射到供体小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到受体小鼠中备孕，繁殖子代；
3)
让基因组中带有外源性
MAPT
基因的子代小鼠与野生型小鼠交配，对交配得到的子代小鼠采用四环素灌胃，直到小鼠出现阿尔茨海默样病理改变，认为得到“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病小鼠模型
。2.
根据权利要求1所述的一种“肠
‑
脑轴”阿尔茨海默病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤
1)
中，将
MAPT、P2A、RFP
及
polyA
尾连接到
pTRE3G
载体上，得到
pTRE3G
‑
MAPT
‑
P2A
‑
RFP
；将
CFOS
与
Sox10MCS4
融合后连接到
rtTA3G
‑
polyA
上，得到
Sox10MCS4
‑
CFOS
‑
rtTA3G
；再将得到的
Sox10MCS4
‑
CFOS
‑
rtTA3G
连接到
pTRE3G
‑
MAPT
‑
P2A
‑
RFP
上，得到
donor
载体
...

【专利技术属性】
技术研发人员：项捷，武胜昔，唐静荣，余小雨，田家欣，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：