携带抗制造技术

本发明专利技术公开了一种携带抗

【技术实现步骤摘要】
携带抗ROR1/抗CD3的抗体基因溶瘤腺病毒的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及携带抗
ROR 1/
抗
CD3
的抗体基因溶瘤腺病毒的构建方法及应用
。

技术介绍

[0002]酪氨酸激酶样孤儿素受体
1(ROR1)
是一种细胞表面蛋白，可介导来自其配体分泌的糖蛋白
Wnt5a
的信号
。Wnt5a
与
ROR1
结合激活
NF
‑
κ
B
，导致
ROR1
二聚体形成进而招募衔接蛋白，这些衔接蛋白会触发
Rho/Rac1 GTP
酶
、PI3K/AKT
和
Hippo
‑
YAP/TAZ
通路的激活，最终导致肿瘤进展和化学耐药性的生物学过程发生
。
[0003]溶瘤腺病毒
(OAd)
是双链
DNA
病毒，其基因组分为早期
(E1
‑
E4)
和晚期
(L1
‑
L5)
转录单元，在病毒
DNA
复制前后转录
。
现有研究表明溶瘤腺病毒对肿瘤细胞具有杀伤作用，抑制肿瘤的生长和延长生存期
。
例如：携带
CXCL10
趋化因子的溶瘤腺病毒，在小鼠结肠癌模型实验中，实现了
CXCL10
在肿瘤微环境中的连续表达，将
CXCR3 T
细胞募集到
TME
中杀死肿瘤细胞
。OAd
‑
CD55
‑
ST13
‑
TRAIL
抑制胰腺导管腺癌肿瘤细胞的增殖和诱导依赖于半胱天冬酶途径的细胞凋亡，在小鼠模型中
CD55
‑
ST13
‑
TRAIL
显著抑制肿瘤的生长并延长生存期
。OAd
‑
TD
‑
nsIL12
对食管鳞状细胞癌细胞具有更强的细胞毒性能显著抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成，提高动物存活率
。
这些都体现了溶瘤腺病毒适合做治疗癌症的病毒载体，具有很大的潜力
。
[0004]双特异性
T
细胞接合器
(BITE)
属于双特异性抗体
(BsAb)
，其组成为抗肿瘤抗原和
CD3
抗体的两个单链可变片段
(scFvs)
，识别肿瘤细胞和招募
T
细胞
。BITE
是容易扩散的小分子，可以快速到达病变部位，进而将
T
细胞重定位到癌细胞发挥细胞毒性作用杀死癌细胞
。
[0005]在癌症研究中，单独
BITE
和单独溶瘤腺病毒对于肿瘤细胞均表现强大的抗肿瘤能力，但将两者联合应用的研究很少
。
利用靶向
ROR1
的
BITE
溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究更是鲜有发现
。

技术实现思路

[0006]为了提高肝癌的治疗效果，扩展肝癌的治疗方法和途径，本专利技术提供以下技术方案
。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种携带抗
ROR1/
抗
CD3
的双特异性抗体基因溶瘤腺病毒的构建方法，其包括以下步骤：
[0008]步骤1，分别构建携带
anti
‑
ROR1 scFv
的质粒
pcDNA3.1
‑
antiROR1 scFv
和携带
anti
‑
CD3 scFv
的质粒
pcDNA3.1
‑
antiCD3 scFv
；
[0009]步骤2，构建携带所述
anti
‑
ROR1 scFv
和所述
anti
‑
CD3 scFv
的质粒
pCA13
‑
ROR1 BITE
；
[0010]步骤3，构建携带
anti
‑
ROR1
和
anti
‑
CD3
的双特异性抗体序列的质粒
pSD55
‑
ROR1 BITE
；
[0011]步骤4，将所述的
pSD55
‑
ROR1 BITE
线性化和去磷酸化，然后转化到感受态
BJ5183
‑
Adeasy
中，同源重组后获得携带
anti
‑
ROR1
和
anti
‑
CD3
的双特异性抗体序列的质粒
pAd
‑
ROR1 BITE
；
[0012]步骤5，将所述的
pAd
‑
ROR1 BITE
线性化和去磷酸化后转染到
HEK293A
细胞，包装后获得所述携带抗
ROR1/
抗
CD3
的双特异性抗体基因的溶瘤腺病毒
ZD55
‑
ROR1 BITE。
[0013]优选地，步骤1包括以下子步骤：
[0014]步骤1‑1，分别合成
anti
‑
ROR1 scFv
和
anti
‑
CD3 scFv
；
[0015]步骤1‑2，将所述
anti
‑
ROR1 scFv
连接到
pcDNA3.1
上获得所述
pcDNA3.1
‑
antiROR1 scFv
，将所述
anti
‑
CD3 scFv
连接到
pcDNA3.1
上获得所述
pcDNA3.1
‑
antiCD3 scFv。
[0016]在步骤1‑1中，
anti
‑
ROR1 scFv
的碱基序列
(SEQ ID NO:1)
如下：
[0017]gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagccagggcggtccctgagactctcctgtacagcttctggatctgacattaatgattatcctattagctggttccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtaggtttcattaatagcggtgggtctacatggtacgcctcgtgggt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种携带抗
ROR1/
抗
CD3
的双特异性抗体基因溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，分别构建携带
anti
‑
ROR1 scFv
的质粒
pcDNA3.1
‑
antiROR1 scFv
和携带
anti
‑
CD3 scFv
的质粒
pcDNA3.1
‑
antiCD3 scFv
；步骤2，构建携带所述
anti
‑
ROR1 scFv
和所述
anti
‑
CD3 scFv
的质粒
pCA13
‑
ROR1 BITE
；步骤3，构建携带
anti
‑
ROR1
和
anti
‑
CD3
的双特异性抗体序列的质粒
pSD55
‑
ROR1 BITE
；步骤4，将所述的
pSD55
‑
ROR1 BITE
线性化和去磷酸化，然后转化到感受态
BJ5183
‑
Adeasy
中，同源重组后获得携带
anti
‑
ROR1
和
anti
‑
CD3
的双特异性抗体序列的质粒
pAd
‑
ROR1 BITE
；步骤5，将所述的
pAd
‑
ROR1 BITE
线性化和去磷酸化后转染到
HEK293A
细胞，包装后获得所述携带抗
ROR1/
抗
CD3
的双特异性抗体基因的溶瘤腺病毒
ZD55
‑
ROR1 BITE。2.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1包括以下子步骤：步骤1‑1，分别合成
anti
‑
ROR1 scFv
和
anti
‑
CD3 scFv
；步骤1‑2，将所述
anti
‑
ROR1 scFv
连接到
pcDNA3.1
上获得所述
pcDNA3.1
‑
antiROR1 scFv
，将所述
anti
‑
CD3 scFv
连接到
pcDNA3.1
上获得所述
pcDNA3.1
‑
antiCD3 scFv。3.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2包括以下子步骤：步骤2‑1，将所述
pcDNA3.1
‑
antiROR1 scFv
进行高保真
PCR

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅刚，詹琦，李强，张慧梨，肖荣，金皓，王迎，贾晓渊，黄飚，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：