一种蛋白突变体在构建高产氨基酸的重组菌中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种蛋白突变体在构建高产氨基酸的重组菌中的应用

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白突变体在构建高产氨基酸的重组菌中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和微生物
，具体涉及一种蛋白突变体在构建高产氨基酸的重组菌中的应用
。

技术介绍

[0002]谷氨酸，化学式为
C5H9NO4
，分子量为
147.13
，是一种酸性氨基酸
。
分子内含两个羧基，化学名称为
α
‑
氨基戊二酸
。
[0003]谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义
。L
‑
谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，谷氨酸盐在自然界普遍存在的
。
多种食品以及人体内都含有谷氨酸盐，它即是蛋白质或肽的结构氨基酸之一，又是游离氨基酸，
L
型氨基酸美味较浓
。
[0004]赖氨酸
(Lysine)
的化学名称为2，6‑
二氨基己酸
。
赖氨酸为碱性必需氨基酸
。
[0005]赖氨酸的分解代谢在肝脏中进行，它与酮戊二酸缩合形成酵母氨基酸，酵母氨基酸再转变为
L
‑
α
‑
氨基己二酸半醛，最终转化生成乙酰辅酶
A。
与其它氨基酸不同，赖氨酸不参与转氨基作用，且脱氨基反应不可逆，因此赖氨酸的分解代谢极为特殊
。
赖氨酸是生糖兼生酮氨基酸，因此可以参与形成
D
‑
葡萄糖
、
糖原
、
脂类，最终产生能量
。
[0006]谷氨酸棒杆菌
(Corynebacterium glutamicum)
是近四十年来全球用以氨基酸发酵工业的主要生产菌，早在
1957
年由
Kinoshita
首次描述其为谷氨酸产生菌
。
谷氨酸棒杆菌在分类上属于革兰氏阳性真细菌下的放线纲棒状杆菌属
。
[0007]CN 112725253A
中提供了一种对棒杆菌中
BBD29_14900
基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，并提到所述方法可以使带有所述突变的菌株提高谷氨酸的发酵产量，但其提升效果不明显，改造验证结果仅限于
5L
发酵罐；同时，其中的突变也仅限于在谷氨酸方面有提升
。

技术实现思路

[0008]已知谷氨酸棒杆菌
MHZ
‑
0112
‑
8(
已在
CN 105695383A
中公开
)
可作为谷氨酸生产菌来进行谷氨酸发酵，并能在性能验证中作为对照菌株进行实验
。
专利技术人在对
MHZ
‑
0112
‑8进行复壮过程中偶然发现
G10
菌株谷氨酸产量提升
。
经测序及分析后，发现
G10
菌株
BBD29_15155
基因
382
位氨基酸由丙氨酸
(A)
突变为苏氨酸
(T)。
在后续研究中发现，当谷氨酸棒杆菌野生型
BBD29_15155
基因所编码蛋白的第
382
位丙氨酸被其他氨基酸取代时，均有助于提高氨基酸
(
尤其包括
L
‑
谷氨酸和赖氨酸
)
的产量
。
[0009]基于上述发现，本专利技术提供了一种蛋白突变体在构建高产氨基酸的重组菌中的应用
。
[0010]具体而言，第一方面，本专利技术首先提供了一种蛋白突变体，或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在以下任一方面的应用：
[0011](1)
构建高产氨基酸或其衍生物的微生物；
[0012](2)
筛选高产氨基酸或其衍生物的微生物；
[0013]与野生型
BBD29_15155
基因编码的蛋白相比，所述蛋白突变体第
382
位丙氨酸被其他氨基酸取代
。
[0014]作为优选，与野生型
BBD29_15155
基因编码的蛋白相比，所述蛋白突变体第
382
位丙氨酸被苏氨酸或赖氨酸取代
。
[0015]更优选的，所述蛋白突变体第
382
位丙氨酸被苏氨酸取代
。
[0016]进一步优选的，所述蛋白突变体的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0017]本领域技术人员应该理解，在上述蛋白突变体序列的
N
端或
C
端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本专利技术的保护范围内
。
[0018]根据上述提供的蛋白突变体，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列
。
基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本专利技术的保护范围内
。
[0019]作为优选，与野生型
BBD29_15155
基因相比，所述蛋白突变体的编码基因的第
1144
位碱基由鸟嘌呤替换为腺嘌呤
。
[0020]作为本专利技术的一种实施方式，所述蛋白突变体的编码基因
(
即
BBD29_15155
基因突变体
)
的碱基序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0021]本专利技术所提到的生物材料为表达盒
、
载体或宿主细胞
。
[0022]所述表达盒为在所述核酸的上游或下游连接用于驱动其转录
、
表达的元件得到的重组核酸分子
。
[0023]所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体
、
噬菌体载体
、
转座子等
。
[0024]所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞
。
[0025]优选所述氨基酸包括
L
‑
谷氨酸和赖氨酸
。
[0026]优选所述微生物为棒杆菌属微生物，更优选为谷氨酸棒杆菌
。
[0027]在进行具体实施时，所述的微生物可通过以下的方法构建得到：
[0028](1)
将含有所述
BBD29_15155
基因突变体的编码基因的表达载体导入微生物细胞中；
[0029](2)
在微生物的染色体上对
BBD29_15155
基因编码基因的启动子替换成强启动子如
Psod、Ptuf本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种蛋白突变体或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在以下任一方面的应用：
(1)
构建高产氨基酸或其衍生物的微生物；
(2)
筛选高产氨基酸或其衍生物的微生物；与野生型
BBD29_15155
基因编码的蛋白相比，所述蛋白突变体第
382
位丙氨酸被其他氨基酸取代
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与野生型
BBD29_15155
基因编码的蛋白相比，其第
382
位丙氨酸被苏氨酸或赖氨酸取代；优选所述蛋白突变体的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。3.
根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，与野生型
BBD29_15155
基因相比，所述蛋白突变体的编码基因的第
1144
位碱基由鸟嘌呤替换为腺嘌呤；更优选所述蛋白突变体的编码基因的碱基序列如
SEQ ID NO.2
所示
。4.
根据权利要求1‑3中任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物所生产的氨基酸包括
L
‑
谷氨酸和赖氨酸
。5.
根据权利要求1‑4中任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为棒杆菌属微生物，更优选为谷氨酸棒杆菌
。6.
一种重组菌，其特征在于，其以保藏编号为
CGMCC No.11941
的谷氨酸棒杆菌
MHZ
‑
0112
‑8为出发菌株构建得到；其表达蛋白突变体；或，其含有所述蛋白突变体的编码基因；所述蛋白突变体或其编码基因同权利要求1‑3中任一项所述
。7.
一种重组菌，其特征在于，其以保藏编号为
CGMCC No.11942
的谷氨酸棒杆菌
MHZ
‑
0912
‑6为出发菌株构建得到；其表达蛋白突变体；或，其含有所述蛋白突变体的编码基因；所述蛋白突变体或其编码基因同权利要求1‑3中任一项所述
。8.
一种生产
L
‑
谷氨酸的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求6所述的重组菌，以产生
、
积累和收集
L
‑
谷氨酸
。9.
根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所使用的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖
50
‑
60g/L
，硫酸铵
10
‑
20g/L
，
KH2PO40.5
‑
1.5g/L
，
...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾贝贝，程江红，牛松峰，李岩，
申请(专利权)人：胡丹，
类型：发明
国别省市：