GITR-OX40制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
GITR
‑
OX40双特异性单链抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的制备方法
。

技术介绍

[0002]T
细胞在抗肿瘤中起到关键作用
。T
细胞表面有很多受体，而这些受体或正或负调控
T
细胞的激活，从而影响
T
细胞介导的抗肿瘤免疫
。
其中，
PD
‑1和
CTLA
‑4是深入研究的抑制
T
细胞激活的两个受体
。
目前，
PD
‑1和
CTLA
‑4的单克隆抗体已经开发并用于癌症的治疗
。
但是，这背后仍然存在很多问题：首先，
PD
‑
1/PD
‑
L1
单克隆抗体并不是对所有类型的肿瘤都有效；第二，存在原发性耐药和获得性耐药；第三，在临床治疗中个体差异很大，在有的患者身上效果显著，而有些则无效
。
除了抑制
T
细胞激活的受体以外，还有一些刺激
T
细胞激活的受体，比如
GITR
和
OX40。
而目前的新疗法则包括活化这些受体路径从而提高
T
细胞的抗肿瘤应答
。GITR
信号通路的激活可以降低
T/>细胞的细胞凋亡
。
同时，
GITR
共刺激能够增强
CD8+T
细胞的细胞毒性作用，并增进骨髓
CD8+
记忆性
T
细胞的存活
。OX40
信号通路激活时，通过介导效应
T
细胞和记忆
T
细胞的激活，增加细胞因子如
IL
‑2，
IL
‑
4,IL
‑5，
IFN
‑
γ
的分泌
。OX40
信号通路激活还能降低调节性
T
细胞
(Tregs)
的免疫抑制活性，从而进一步放大效应性
T
细胞的激活效应
。
因此不同于市面上的标砖免疫检查点阻断抗体，靶向
GITR
和
OX40
的双特异性抗体可以直接激活和调节免疫反应，更加高效有针对性的监测并改善肿瘤微环境
。

技术实现思路

[0003]本专利技术主要解决的技术问题是提供一种分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的制备方法，能够联合
T
细胞及巨噬细胞同时作用，杀伤肿瘤细胞
。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的制备方法，包括步骤为：
[0005](1)
扩增抗
GITR
和
OX40
人源化抗体的轻链可变区，并融合具有引导分泌到细胞外序列的
cDNA
；
[0006](2)
扩增抗
GITR
和
OX40
抗体的重链区，并融合具有引导分泌到细胞外序列的
cDNA
；
[0007](3)
经酶切，克隆到
pcDNA3.1(+)
质粒的
BamHI/EcoRI
位点，并得到具有表达的抗体分子；
[0008](4)
转染
COS
细胞表达后，提取分泌到细胞外上层清液中并体外组装成的
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体
。
[0009]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤
(1)
中所述抗
GITR
和
OX40
人源化抗体的轻链可变区是以串联方式连接的
。
[0010]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤
(2)
中所述抗
GITR
和
OX40
抗体的重链区是以串联方式连接的
。
[0011]在本专利技术一个较佳实施例中，所述
pcDNA3.1(+)
质粒包括
GITRVH
‑
Fab
‑
OX40VH
和
GITRVL
‑
OX40VL
，所述
GITRVH
‑
Fab
‑
OX40VH
的氨基酸序列为
SEQ ID NO.1
，所述
GITRVH
‑
Fab
‑
OX40VH
的氨基酸序列为
SEQ ID NO.2。
[0012]本专利技术的有益效果是：本专利技术的分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的制备方法，人源化单链双特异抗体选择靶向
GITR
和
OX40
共刺激受体，具备激活巨噬细胞和
T
细胞的能力，双特异性单链抗体是分泌型的，能分泌到细胞外，利于纯化，双特异性单链抗体采用串联设计，组装的双特异性抗体能同时结合免疫细胞表面
GITR
和
OX40
共刺激受体
。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
[0014]图1是本专利技术所述分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体质粒的序列和结构图；
[0015]图2是本专利技术所述分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体质粒的图谱；
[0016]图3是本专利技术所述分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的检测结果图；
[0017]图4是本专利技术所述分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的功能检测结果图；
[0018]图5是本专利技术所述分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的应用示意图，分泌型重组人源化
GITR
‑
OX40
双特异性单链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤为：
(1)
扩增抗
GITR
和
OX40
人源化抗体的轻链可变区，并融合具有引导分泌到细胞外序列的
cDNA
；
(2)
扩增抗
GITR
和
OX40
抗体的重链区，并融合具有引导分泌到细胞外序列的
cDNA
；
(3)
经酶切，克隆到
pcDNA3.1(+)
质粒的
BamHI/EcoRI
位点，并得到具有表达的抗体分子；
(4)
转染
COS
细胞表达后，提取分泌到细胞外上层清液中并体外组装成的
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体
。2.
根据权利要求1所述的
GITR
‑
OX40
双特异性单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤
(1)
中所述抗
GITR
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘合宾，何开杰，徐伟杰，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：