一种酶的单分子包埋方法技术

本发明专利技术公开了一种酶的单分子包埋方法。该方法首先将酶修饰剂Ｎ－丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐与酶分子上的氨基反应，使单个酶分子接上双键，然后使双键与交联剂反应将单个酶分子包埋其中。本发明专利技术的每个包埋颗粒中心只含单个酶分子，酶分子外层的网格结构往往制成纳米级厚，这使单分子包埋的酶具有比表面积大、扩散传质阻力低、催化活力高、稳定性好等特性，而且具有工艺简便，条件温和，酶活收率高和适用环境范围广等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
酶是生物体内至关重要的一种生物催化剂，它的高效专一、反应条件温和、绿色环 保等优点使酶从人类文明诞生之初就吸引了人们的注意。然而由于酶的蛋白质本质，它的 生物结构极易受环境影响而发生改变或破坏，所以酶的稳定性差，易失活，应用范围往往仅 限于水溶液，不能适应大部分的工业应用，故目前应用的酶往往都是进行过固定化的。自从上世纪70年代开始，酶的固定化已成为酶工程中一大重要研究领域，并得到 了广泛的实际应用。固定化是运用可靠的方法将酶稳定的连接到可溶或不溶性的载体上， 从而很好的解决了酶的稳定性差，不易重复利用、成本高等缺点，使越来越多的酶应用于制 药、农业、环境等领域。酶的固定化通常可以采用四种方法吸附法，包埋法、共价法和交联法。其中包埋 法是比较常用的一种方法，其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应， 将酶固定于载体材料的网格中。故包埋法通用性强、负载量大、便于与其他方法协同使用。 但此法制备的固定化酶往往外壳较厚，酶不易与底物接触；包埋材料未与酶交联导致酶构 象易变，稳定性较差，而单分子包埋法可解决这些问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，它所提供的酶的单分子包埋颗 粒具有比表面积大、扩散传质阻力低、催化活力高、稳定性好等优点。本专利技术采用的技术方案如下该方法首先将酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐与酶分 子上的氨基反应，使单个酶分子接上双键，然后使双键与交联剂反应将单个酶分子包埋其 中。该方法的具体步骤如下①将酶粉溶解在缓冲溶液中配制成浓度为2g/L 20g/L的酶液备用，将酶修饰剂 溶于有机溶剂中备用，浓度为100g/L 500g/L ；②将酶液与酶修饰剂置于20 40°C水浴中振荡反应1 5h，使单个酶分子接上 双键，并用缓冲溶液透析12 48h除去未反应的小分子；③将交联剂与上述步骤②得到的修饰后酶液混合，然后加入引发剂，20 60°C下 反应3 8h，整个过程需N2保护，然后研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒；④上述步骤②中的酶液体积为10ml，则加入的酶修饰剂体积为0. Iml 10ml， 步骤③中加入的交联剂总质量为2g 6. 2g，引发剂为质量浓度5%的过硫酸铵0. Iml 0.8ml和N，N，N' , N'-四甲基二乙胺0. Olml 0. 05ml或质量浓度4 %的过硫酸钾 0. 5ml Iml和亚硫酸氢钠0. Ig 0. 3g。所述的酶为辣根过氧化物酶、蛋白酶或葡糖氧化酶。所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸钠_碳酸氢钠缓冲液或磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液。 所述的酶修饰剂为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐。所述的有机溶剂为二甲基亚砜、氯仿、丙酮或二甲基甲酰胺。所述的交联剂为二缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯、 聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和一些分子结构至少含有2个乙二醇片段 及碳_碳双键的化合物，或上述交联剂中的任意一种与丙烯酰胺、N，N-双甲基亚丙烯酰胺、 三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种组成的复合交联剂。本专利技术具有的有益效果本专利技术所提供的包埋颗粒中心只含单个酶分子，使酶分子与底物的接触几率达到 最高；酶分子外层的网格结构往往制成纳米级厚，传质阻力降到最低；酶外层的交联材料 与酶分子上的氨基共价连接，强化稳定了酶分子的构象。这些特性使单分子包埋的酶具有 催化活力高、稳定性强、比表面积大、传质阻力小、耐有机溶剂能力强等其它方法所不具有 的优点。该方法具工艺简便，条件温和，酶活收率高和适用环境范围广等优点具体实施例方式实施例1 首先，称取辣根过氧化物酶粉(或以上的任何一种酶粉，以下相同)溶解在磷酸盐 缓冲溶液中配制成2g/L的酶液备用，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶于二甲基亚砜 中配制成100g/L的NAS液备用。然后，将IOml辣根过氧化物酶液与0. Iml NAS液混勻，置 于30°C恒温水浴中振荡反应3h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析12h除去未反应的 小分子。将3ml聚乙二醇400 二甲基丙烯酸酯、50mg丙烯酰胺加入修饰后的上述酶液之中， 通N2IOmin,待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度5%的过硫酸铵0. 3ml、N，N，N' ,N'-四 甲基二乙胺0.015ml引发反应，35°C下反应4h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单 分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为94%，聚合反应收率为98%。在4°C储存30天后，酶 的活性保持原有活性的96. 8%。实施例2 首先，称取辣根过氧化物酶粉溶解在磷酸盐缓冲溶液中配制成10g/L的酶液备 用，将丙烯酰氯溶于氯仿中配制成500g/L的丙烯酰氯液备用。将IOml辣根过氧化物酶液 与Iml丙烯酰氯液混勻，20°C下振荡反应5h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析24h除 去未反应的小分子。将4ml三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯加入修饰后的上述酶液之中，通 N2IOmin,待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度5%的过硫酸铵0. 1ml、N, N, N' , N'-四 甲基二乙胺0. 05ml引发反应，35°C下反应3h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分 子包埋颗粒。测得酶的活性收率为85%，聚合反应收率为92%。在4°C储存30天后，酶的 活性保持原有活性的91%。实施例3 首先，称取胰凝乳蛋白酶粉溶解在硼酸缓冲溶液中配制成20g/L的酶液备用，将 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中配制成300g/L的NAS液备用。将IOml胰凝乳蛋白酶液与IOml NAS液混勻，30°C下振荡反应3h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析 48h除去未反应的小分子。将6ml聚乙二醇200 二丙烯酸酯、200mg三羟甲基丙烷三甲基丙 烯酸酯加入修饰后的上述酶液之中，通N2IOmin,待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度4% 的过硫酸钾1ml、亚硫酸氢钠0. Ig引发反应，20°C下反应8h。然后经研磨、清洗、过滤及冻 干制成酶的单分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为82%，聚合反应收率为95%。在4°C储 存30天后，酶的活性保持原有活性的89%。实施例4 首先，称取胰凝乳蛋白酶粉溶解在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中配制成2g/L的酶 液备用，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中配制成100g/L的NAS液备用。将 IOml胰凝乳蛋白酶液与2ml NAS液混勻，30°C下振荡反应4h，使酶分子接上双键，再用缓冲 溶液透析48h除去未反应的小分子。将4ml聚乙二醇400 二甲基丙烯酸酯加入修饰后的上 述酶液之中，通队10!^11，待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度4%的过硫酸钾0. 5ml、亚硫 酸氢钠0. 3g引发反应，35°C下反应5h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋 颗粒。测得酶的活性收率为98%，聚合反应收率为91%。在4°C储存30天后，酶的活性保 持原有活性的90%。实施例5 首先，称取葡糖氧化酶粉溶解在磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液中配制成5g/L的酶液 备用，将衣康酸酐溶于二甲基亚砜中配制成100g/L的衣康酸酐液备用。将IOml葡糖氧化酶 液与5ml衣康酸酐液混勻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶的单分子包埋方法，其特征在于：该方法首先将酶修饰剂Ｎ－丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐与酶分子上的氨基反应，使单个酶分子接上双键，然后使双键与交联剂反应将单个酶分子包埋其中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋锡瑾，徐佳音，厉瑾，王杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]