一种基于制造技术

本发明专利技术涉及一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
‑
dCas13系统的量子点标记病毒核酸的方法及应用


[0001]本专利技术属于化学及生物医学领域，尤其是涉及一种基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法及应用
。

技术介绍

[0002]病毒的感染过程极其复杂，揭示病毒的感染机制对于阻断病毒感染
、
防御病毒性疾病具有重要意义
。
基于量子点的单病毒示踪
(Single
‑
Virus Tracking)
技术能够以纳米级精度示踪单个病毒的轨迹，并提取病毒感染的动态信息
。
利用量子点的高亮度和优异的光稳定性，可以实现单颗量子点标记目标物，从毫秒到几个小时的时间内连续成像
。
因此，该方法不仅可以实现对多个病毒侵染过程进行群体化示踪，还可以对单个病毒在细胞内的个体侵染行为进行跟踪分析，已成为研究病毒侵染机制的强有力手段
。
为了监测病毒在活细胞内的整个感染过程，一个至关重要的要求是在不干扰病毒感染性的情况下，在单个病毒水平上分别同时标记病毒的内外成分，其中对病毒核酸的标记一直是一个热点难题
。
[0003]目前已报道的量子点标记病毒核酸的方法有：通过电穿孔将
QD
标记的核蛋白抗体转移到甲型流感病毒
(Influenza Avirus,IAV)
内部，通过抗原
‑
抗体相互作用标记病毒核蛋白复合物
(vRNP)(Anal.Chem.2018,90,23,14020
–
14028)
；通过病毒基因组的互补序列将
QDs
与
HIV
‑1慢病毒基因组
RNA
体外结合，在病毒组装期间封装到病毒粒子中
(ACS Nano 2013,7(5),3896
–
3904)
；在
IAV
组装期间将
QD
标记的
vRNP
封装到
IAV
内部，并使用
QD
标记病毒包膜，从而有可能实时获取单个
IAV
核酸释放的动态信息
(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2019,116(7),2577
‑
2582)
，但需要对核酸进行基因修饰；基于
QD
‑
纳米信标的标记方法，利用
QDs
和猝灭剂标记单个
HIV
的
RNA
，标记的子代病毒实现了病毒核酸释放过程的可视化
(J.Am.Chem.Soc.2019,141(34),13454
‑
13458)
；基于
CRISPR
‑
dCas9
系统对双链
DNA
的特异性识别实现
QD
标记
PRV
的核酸，这有助于研究实时监测病毒在宿主细胞中的结合
、
进入和转运过程
(Nano Lett.2020,20(2),1417
‑
1427)
，但对蛋白的提取和纯化步骤繁琐，且无法实现对
RNA
病毒的标记
。
[0004]日本脑炎病毒
(JEV)
属黄病毒科，是一种直径在
50nm
左右的包膜病毒，基因组是一条长约
11kb
的单股正链
RNA
，是一种具有单链正义
RNA
基因组的包膜病毒，其表面糖蛋白与细胞表面的受体结合通过内吞作用实现感染性进入
。
目前还未有报道量子点标记
JEV
核酸的方法
。JEV
在
Vero
细胞中的运动是由微管上的
dynein
驱动，它通常将病毒运送到核周区的晚期内体依赖
pH
的变化释放基因，基因组转运到内质网上进行复制和组装
。
但是
JEV
释放基因后的动态行为仍然是未知的
。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法及应用
。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法，构建含有表达
dCas13
的质粒
、
含有
gRNA
的质粒
、
生物素和
BirA
酶的细胞体系，其中，表达
dCas13
的质粒上还包括生物素受体肽标签；向细胞体系中转入链酶亲和素修饰的量子点，再向细胞体系接种病毒毒株，培养后得到量子点标记的病毒
。
[0007]优选地，
gRNA
靶向病毒核酸序列，先合成得到
dCas13
‑
Bio/gRNA
复合物再与
SA
‑
QD
结合
。
[0008]优选地，生物素受体肽标签为
AP tag。
[0009]优选地，病毒为黄病毒，优选为日本脑炎病毒
。
[0010]优选地，具体方法如下：
[0011]步骤一：构建能够高效表达
dCas13
和生物素受体肽标签
AP tag
的质粒；
[0012]步骤二：设计筛选一条或多条靶向病毒核酸序列的
gRNA
，构建得到含有
gRNA
的质粒；
[0013]步骤三：在培养的细胞中加入生物素
、
步骤一制备的质粒
、gRNA
的质粒和表达
BirA
酶的质粒，加入转染试剂进行转染后培养细胞；再向上述细胞体系中加入链酶亲和素修饰的量子点
SA
‑
QDs
，加入转染试剂转染，细胞培养；再向细胞体系中接种病毒毒株，培养后得到量子点标记的病毒
。
[0014]优选地，
gRNA
序列如
SEQ ID No.2
‑5所述
。
[0015]一种双色量子点标记病毒的方法，包括如下步骤：
[0016]步骤
A
：通过上述方法标记病毒核酸；
[0017]步骤
B
：通过糖代谢途径将叠氮基团修饰到病毒包膜上；
[0018]步骤
C
：通过二苯并环辛炔
(DBCO)
与叠氮基团的反应将量子点修饰到病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法，其特征在于：构建含有表达
dCas13
的质粒
、
含有
gRNA
的质粒
、
生物素和
BirA
酶的细胞体系，其中，表达
dCas13
的质粒上还包括生物素受体肽标签；向细胞体系中转入链酶亲和素修饰的量子点，再向细胞体系接种病毒毒株，培养后得到量子点标记的病毒
。2.
根据权利要求1所述的基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法，其特征在于：
gRNA
靶向病毒核酸序列，先合成得到
dCas13
‑
Bio/gRNA
复合物再与
SA
‑
QD
结合
。3.
根据权利要求2所述的基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法，其特征在于：生物素受体肽标签为
AP tag。4.
根据权利要求3所述的基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法，其特征在于：病毒为黄病毒，优选为日本脑炎病毒
。5.
根据权利要求4所述的基于
CRISPR
‑
dCas13
系统的量子点标记病毒核酸的方法，其特征在于：具体方法如下：步骤一：构建能够高效表达
dCas13
和生物素受体肽标签
AP tag

【专利技术属性】
技术研发人员：庞代文，马爱新，王志刚，刘书琳，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：